针对加工副产物鲍鱼外套膜利用率低的现象，对鲍鱼腹足和外套膜胶原蛋白相关性质进行比较研究，以期为鲍鱼的综合加工提供一定的理论依据。本研究以皱纹盘鲍为原料分别提取得到腹足酶促溶性胶原蛋白（ｐｅｐｓｉｎ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｏｆ ａｂａｌｏｎｅ ａｄｄｕｃｔｏｒ，ｐｓｃ１）和外套膜酶促溶性胶原蛋白（ｐｅｐｓｉｎ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｏｆ ａｂａｌｏｎｅ ｍａｎｔｌｅ，ｐｓｃ２），对ｐｓｃ１和ｐｓｃ２相关特性进行比较分析，并利用ｐｓｃ１制备得到兔抗鲍鱼胶原蛋白多克隆抗体。ｓｄｓ－ｐａｇｅ显示，ｐｓｃ１和ｐｓｃ２分子组成均为（α１）３，且α１的分子量为１４０ ｋｕ，与水产无脊．．．

利用分光光度计比色法测定了2－3cm的皱纹盘鲍（HaliotisdiscushannaiIno）的蛋白消化酶的最适温度、最适pH以及11种金属离子对其的影响。结果表明：在最适温度50℃下的活化能为4．89×10~4J／mol；最适pH为2．60和5．00。对其最适pH值的分析表明：皱纹盘鲍存在有胃蛋白酶，且活性颇高。在11种离子中，Cu~(2+)、Hg~(2+)、Ag~+对蛋白酶活性具有显著的抑制作用，而Fe~(3+)。Mg~(2+)则具有一定的促进作用。

为了研究鲍鱼肌原纤维中副肌球蛋白(PM)的性质,以皱纹盘鲍为原料,采用硫酸铵盐析和羟基磷灰石柱层析相结合的方法,从肌肉中纯化得到PM。利用肽质量指纹图谱测定其内部肽片段氨基酸序列;采用双向电泳测定其等电点;用圆二色谱研究其二级结构特征,进一步利用红外光谱对其官能团进行表征。SDS-PAGE结果显示,PM分子量约为97.0 ku。肽质量指纹图谱分析获得36条肽段共403个氨基酸残基,与盘鲍和太平洋牡蛎PM的一致性分别为99.7%和72.0%,表明纯化蛋白确为PM。双向电泳测得PM等电点约为5.4,证明其为一

【目的】构建溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核表达载体,优化OmpK蛋白的诱导表达条件,制备OmpK蛋白小鼠多克隆抗体。【方法】通过PCR扩增获得ompK基因,连接pET-32a质粒构建OmpK-pET32a载体,将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达。利用切胶纯化获得OmpK蛋白后,免疫小鼠制备OmpK蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价,Western-Blotting法检测抗血清特异性。通过正交试验,获得OmpK菌株的最佳诱导表达条件与培养条件。【结果】PCR扩增获得了长816bp的ompK基因;成功构建了OmpK-pET32a载体,其诱导表达产物分子质量为30ku,与预期结果一致。E...

本研究从皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)中鉴定并克隆了一种肽聚糖识别蛋白(PGRP)，命名为HdPGRP。HdPGRP的cDNA全长为1467 bp，共编码354个氨基酸，其中含有1个信号肽(1～18氨基酸)、1个SH3b结构域(93～160氨基酸)、1个PGRP结构域(179～322氨基酸)和1个Ami＿2结构域(191～332氨基酸)。此外，在HdPGRP序列中发现了4个保守的Zn~(2+)结合位点(H~(209)、Y~(255)、H~(318)和C~(330))以及5个保守的酰胺酶催化位点(H~(209)、Y~(255)、H~(318)、T~(328)和C~(330))。经多序列比对和系统发育树分析，表明HdPGRP属于短型PGRP家族成员。在健康鲍鱼中，hdpgrp主要在肝胰腺中表达，其次依次是在血细胞、外套膜和鳃中。在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激后，血细胞中的hdpgrp表达量在72 h内呈现先上升后下降的趋势，在24 h表达量达到最高。SDS-PAGE结果显示，重组HdPGRP（rHdPGRP）的分子量为30kDa。rHdPGRP表现为Zn~(2+)依赖酰胺酶活性，可催化降解不溶性肽聚糖。此外，rHdPGRP对革兰氏阳性菌藤黄微球菌(Micrococcus luteus)具有显著的抑制作用，且这种抑制作用可能与其酰胺酶活性有关。本研究表明，HdPGRP在机体抵御入侵细菌等免疫防御中起重要作用。

以草鱼鱼鳞为材料,研究蛋白酶种类、酶解条件对鱼鳞酶水解的水解度、氮收率和凝胶强度的影响,并采用正交试验对鱼鳞胶原肽制备工艺进行优化,以获得较高凝胶强度的鱼鳞胶原肽。结果表明:在胃蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶4种蛋白酶中,采用胃蛋白酶水解鱼鳞胶原蛋白时氮收率较高,且水解产物具有凝胶形成能力;酶解条件对鱼鳞胶原蛋白的水解度、氮收率和凝胶强度均有显著影响;胃蛋白酶在底物质量分数为5%、起始pH值为4.0、加酶量为140 U/g、水解温度为65℃条件下,水解鱼鳞120 min,鱼鳞水解产物的凝胶强度和氮收率都较好,其中水解度为1.46%、氮收率为64.38%、凝胶强度为2 051 g。

以草鱼（Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ ｉｄｅｌｌｕｓ）鳞为原料，采用３种常用工业蛋白酶酶解３种经不同预处理方法处理过的鱼鳞，经酶解、离心分离、冷冻干燥等工序制备胶原蛋白肽，比较不同预处理方法制得胶原蛋白肽的产率及产物特性。结果表明，预处理方法对鱼鳞酶解产物的氮收率、水解度和氨基氮生成量有显著影响（ｐ

采用重复漂洗 离心法分离纯化了杜仲橡胶颗粒 ,SDS_PAGE分析发现杜仲橡胶颗粒含有十几种蛋白 ,其中以 5 6ku、30ku 2种蛋白的丰度较高 ,分别称之为EuRPP56 和EuRPP30 。对杜仲雌雄株的比较表明 ,杜仲雌株叶片、雌株树皮及果皮中橡胶颗粒蛋白均是EuRPP30 含量高于EuRPP56 ,而雄株叶片、雄株树皮中正相反。进一步分离纯化了杜仲橡胶颗粒中丰度较高的 30ku蛋白 ,并制备了该蛋白的抗体。免疫细胞化学分析结果表明 ,在叶片的含胶细胞中有阳性反应 ,而其它细胞无阳性反应。以上工作为研究杜仲胶粒结合蛋白功能以及阐明杜仲胶生物合成机制奠定基础

Vasa基因具有在性腺中特异表达的特点,在生殖细胞分化与发育过程中起重要作用。从日本沼虾精巢cDNA中克隆了vasa基因的阅读框,连接到pET-32a载体,构建重组表达质粒pET32a-vasa,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导融合表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约85ku,表达量约占包涵体总蛋白的48.7%,Western-blotting检测表明,融合蛋白可特异地被anti-HIS标签抗体识别。用Ni2+-NTA纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备获得多克隆抗体,ELISA显示该抗体效价达1∶160000,Western免疫鉴定显示该抗体不仅能识...

【背景】轮状病毒（Rotavirus,RV）是全球范围内幼儿和各种幼畜急性病毒性胃肠炎的主要原因之一，在公共卫生中具有重要意义。猪轮状病毒病是一种由猪轮状病毒（Porcine Rotavirus,PoRV）引起的一种急性肠道传染病，常造成仔猪消化道功能紊乱，引发严重的呕吐、腹泻和脱水症状，一旦爆发将对养猪业造成重大经济损失。目前，针对PoRV感染尚无特效药物治疗，疫苗接种是控制感染的最经济的途径。然而，PoRV基因型多且易变异，不同基因型之间的交叉保护很不理想。因此，亟需加强对PoRV的流行病学监测和致病机制研究，探索新型防控策略。【目的】利用大肠杆菌原核系统表达PoRV NSP2、NSP4和NSP5非结构蛋白并免疫家兔获得相应多克隆抗体，为PoRV的防控和致病机制研究提供技术手段。【方法】将PoRV的NSP2、NSP4和NSP5基因进行密码子优化后，克隆到pCold-sumo载体中。将测序正确的阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导获得重组蛋白。利用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达情况。对重组蛋白进行亲和层析柱纯化和定量后，采用皮下多点注射方法接种新西兰大白兔，每隔14 d加强免疫一次，经过3次免疫后制备多克隆抗体。采用间接ELISA方法测定多克隆抗体的效价、间接免疫荧光（IFA）和Western blot验证多克隆抗体与PoRV的反应性。再通过Western blot进一步检测PoRV感染过程中3个非结构蛋白的动态表达，以及鉴定3个重组真核质粒转染的效果。【结果】NSP2、NSP4和NSP5重组菌能够有效表达目的蛋白，SDS-PAGE分析可在目标位置清晰观察到明显条带，并且目的蛋白以可溶性形式存在。3个重组蛋白制备的多克隆抗体，ELISA效价均超过1﹕81 000，表明重组蛋白免疫原性良好。IFA结果表明3个多克隆抗体均能够与优势流行基因型轮状病毒发生特异性反应，与其他常见腹泻病原无反应。Western blot结果也展示了研究制备的NSP4、NSP5多克隆抗体可用于病毒感染过程中非结构蛋白的动态表达以及真核质粒转染的鉴定。而NSP2多克隆抗体未能特异性识别到PoRV感染后的NSP2蛋白的表达，但特异性检测到NSP2重组质粒转染后的NSP2蛋白表达，这一结果可能与NSP2的表达特性有关，有待进一步研究确认。随后进行的真核质粒转染验证以及PoRV感染过程中非结构蛋白的动态表达检测结果也验证了本实验制备多克隆抗体的实用性。【结论】成功利用大肠杆菌表达了PoRV的NSP2、NSP4和NSP5非结构蛋白，并获得效价高、特异性良好的多克隆抗体，为PoRV致病机制研究和防控技术研发奠定基础。

[目的]克隆草原短尾羊Brachyury基因(即T基因)编码区(CDS),并制备Brachyury蛋白特异性多克隆抗体,为草原短尾羊短尾表型机制研究提供重要的试验材料。[方法]提取草原短尾羊16 d胚胎的组织RNA,反转成cDNA,以cDNA为模板,采用PCR方法克隆草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列。将Brach yury基因CDS全长序列连接至pEASY~?-Blunt E1载体,构建原核表达载体pEASY~?-Blunt E1-Brach yury,并进行NheⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定。将原核表达载体导入RosettagamiB(DE3)大肠杆菌,并进行IPTG诱导表达,对表达产物进行回收纯化。利用纯化后的表达产物免疫6周龄日本大耳白兔,用间接ELISA(iELISA)法测定血清多克隆抗体效价。以制备的多克隆抗体为一抗,采用Western blot法检测草原短尾羊16,20,25和30 d胚胎中Brachyury蛋白的表达水平。[结果]克隆了1335 bp的草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列,成功构建了原核表达载体pEASY~?-Blunt El-Brachyury,表达获得了49.16 ku的重组Brachyury蛋白。成功制备了重组Brachyury蛋白多克隆抗体,抗体效价达1:1 500,该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白。草原短尾羊16d胚胎中Brachyury蛋白的表达量最高。[结论]成功制备草原短尾羊Brachyury蛋白兔血清多克隆抗体,抗体效价为1:1 500,该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白。

【目的】构建重组兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)VPg(Viral Protein Ge-nome-Linked,VPg)蛋白基因的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达和纯化VPg蛋白,制备多克隆抗体,并检测抗体的基本特性。【方法】用PCR方法扩增RHDVVPg基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导,使之重组表达VPg蛋白,并用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。PCR扩增获得了345bp的VPg基因,用纯化的重组VPg蛋白免疫试验兔,制备抗VPg的多克隆抗体,用Wes...

为构建小鼠BMP3蛋白原核表达载体,纯化BMP3蛋白,制备并鉴定BMP3蛋白小鼠多克隆抗体,以及对BMP3进行系统进化关系研究。采用RT-PCR方法从小鼠肝脏中克隆获得BMP3蛋白的表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得BMP3蛋白,免疫小鼠制备BMP3蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度达1∶3 200倍,Western Blotting证实抗血清具有很好的特异性。通过DNAMAN软件对BMP3序列同源性分析发现其C-端在不同动物间存在较高同源性;MEGA软件对BMP3序列的系统发生分析证实BMP3在动物间具有明显的进化趋势。为BMP3蛋白调控骨代谢及与肿瘤的关...

从中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)和罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)卵巢cDNA中克隆了cyclin B基因的开放阅读框,分别连接到pGEX-2T和pET-32a表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白GST-EsCB和Trx-MrCB。通过优化培养温度、IPTG浓度以及诱导时间,得出重组蛋白的最佳表达条件分别为:0.1 mmol/L IPTG、37℃、4 h和0.1 mmol/L IPTG、30℃、6 h。重组蛋白主要以包涵体形式存在。亲和层析纯化重组蛋白,作为抗原免疫家兔,制备GST-EsCB和Trx-MrCB多克...

为研究L蛋白在乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus, SHVV)增殖过程中发挥的作用,扩增SHVV L基因的前900个碱基,将其克隆到载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET32a-L,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。设置不同温度、IPTG浓度及诱导时间,选择最佳的表达条件。通过NI-NTA亲和层析柱纯化蛋白,并利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。用Western blot鉴定抗体特异性,间接免疫荧光观察L蛋白在SHVV感染斑点叉尾鮰卵巢细胞(channel catfish ovary, CCO)中的定位情况。结果显示,纯化的L蛋白分子质量约42 ku,与预期大小相符。制备的L蛋白多克隆抗体可以与L蛋白发生特异性免疫反应,且L蛋白主要定位在细胞质,表明L蛋白多克隆抗体制备成功。