为建立水稻-根瘤菌共生固氮体系,将百脉根共生信号转导途径中的4个功能基因(LHK1、NSP1、NSP2和NIN)转入水稻,获得稳定转化的转基因水稻,并初步检测转基因水稻的表型和转录组水平上的差异。根瘤菌感染试验结果显示,根瘤菌侵染对照(转入空载体)和转基因水稻的根毛和表皮的比率没有显著变化,但接种根瘤菌14d后,对照与转基因水稻的侧根原基数有显著差异,转共生基因水稻的侧根原基明显增多。利用水稻cDNA芯片,检测转基因水稻组与对照组在接种根瘤菌7d和不接种根瘤菌条件下根的转录组变化,结果显示,转基因组与对照

水稻LIR1是LIR(light-induced rice)蛋白家族的一员,受光与生物钟的调节,在植物光反应及生物节律性调控方面有重要作用。为了研究水稻LIR1的生理功能,利用半定量RT-PCR技术对水稻‘珍汕97B’LIR1基因做了根、叶鞘、叶片及穗的组织特异性表达分析,同时构建了启动子的GUS基因融合表达载体LIR1∷GUS转化烟草,利用GUS组织化学染色检测GUS基因在烟草组织器官中的表达情况。研究结果表明:LIR1基因在水稻叶片中的表达量较高,而在叶鞘、穗与根中表达量较低;GUS染色主要集中在叶片组织及茎中,而在植株的根部不显色。

[目的]调查不同氮肥水平处理对水稻OsAAP6基因表达的影响,并进一步探究OsAAP6基因在不同氮肥条件下对其水稻籽粒中蛋白质(包括谷蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和清蛋白)含量和氨基酸含量等营养品质的影响作用,为今后利用OsAAP66基因提高稻米营养品质提供参考。[方法]设置5个氮肥浓度梯度,在水稻OsAAP6遗传材料中分别检测OsAAP6基因的表达水平,并利用近红外谷物分析仪和考马斯亮蓝G-250法检测分析其成熟种子中蛋白质含量和氨基酸含量等稻米营养品质性状。[结果]随着田间氮肥施加量的增加,OsAAP6基因的表达水平明显提高,并能显著促进水稻籽粒中谷蛋白的积累,进而增加水稻籽粒中总蛋白质的含量;在氮肥浓度较高的条件下,OsAAP6基因有助于提高水稻籽粒中总必需氨基酸的含量;随着氮肥施加量的增加,OsAAP6基因能够显著提高水稻籽粒中总氨基酸的含量。[结论]OsAAP6基因随着田间氮肥浓度的增加,其表达水平不断升高,并能促进水稻籽粒中蛋白质含量和氨基酸含量等稻米营养品质的提高,这为今后利用OsAAP6基因提高稻米的营养品质提供了重要参考。

为将高效特异的启动子用于转基因水稻研究,利用PCR技术从水稻‘中花11’基因组DNA中克隆了rbcS启动子,序列分析表明,扩增片段(2 746 bp)与已报道的该基因序列相应区域的同源性达99.2%。将rbcS启动子与GUS报告基因融合构建了由rbcS启动子引导GUS基因的植物表达载体,经农杆菌介导法导入到水稻中。对转基因水稻植株中GU S活性的定性与定量测定结果表明,rbcS启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片中的特异性表达,其表达水平高于C aMV 35S组成型启动子,而在转基因水稻植株根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出明显的组织特异性。

根据胚胎发育后期丰富蛋白基因OsLEA19a的读码框序列设计引物,PCR扩增目的基因后,利用基因重组技术成功构建原核表达载体pET30a-OsLEA19a,并将重组质粒转化到E.coli BL21中。优化诱导OsLEA19a表达的条件,使目的蛋白可在E.coli BL21中高效表达。OsLEA19a融合蛋白的SDS-PAGE电泳分析表明,诱导蛋白表达的最适条件是37℃、4 h,融合蛋白的大小大约为30 kDa。抗逆性分析表明,OsLEA19a的表达能增强大肠杆菌对高盐、高渗透压、高温和低温等非生物胁迫的抗性。

为研究水稻中PLT基因的表达及功能,利用同源序列分析,在水稻基因数据库中检索到2个与拟南芥PLT基因高度同源的基因序列,命名为OsPLT7和OsPLT11。根据进一步预测的PLT启动子序列设计引物,以水稻品种中花11的基因组DNA为模板,用PCR方法扩增得到PLT7、PLT11的启动子片段,克隆至含有报告基因的表达载体上并转化水稻。通过GUS染色观察T1代转基因阳性植株,发现OsPLT7和OsPLT11在水稻根部干细胞小生境和中柱部位表达,表达模式类似于其同源基因在拟南芥中的表达谱。

【目的】建立转基因水稻中GUS蛋白质的免疫学检测方法,并了解花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动的GUS蛋白质在转基因水稻中的表达特征。【方法】以细菌基因组DNA为模板,PCR扩增GUS基因后克隆到表达载体pET30a中,测序验证的重组子转入大肠杆菌表达菌BL21中,IPTG诱导获得重组表达的GUS蛋白质,用HIS-tag beads纯化后作为免疫原免疫小鼠制备GUS蛋白质特异的抗体,通过免疫印迹分析筛选高特异性的单克隆抗体,用Broadford法对重组的GUS蛋白质进行定量,对不同浓度的GUS蛋白质进行免疫印迹分析,绘制检测GUS蛋白质的标准曲线,通过与标准曲线的比较对水稻叶片中GUS...

通过半定量RT-PCR分析了水稻的SEX1同源基因OsSEX1-1和OsSEX1-2的表达过程,结果表明:2个目的基因表达量均呈现昼夜节律变化。光照对2个基因的表达是必需的,其中以19:00时表达量最高,黑暗条件下表达量较低;叶片淀粉的含量也呈现昼夜节律变化;海藻糖抑制2个基因表达,并导致夜晚叶片淀粉异常积累;在自然光照/黑暗条件下,未观察到不同时段2个基因DNA甲基化差异。

【目的】分离水稻WRKY80,分析其编码蛋白的序列结构特征,了解其在各器官中以及病原接种、激素处理下的表达模式,为阐明其生物学功能奠定基础。【方法】基于水稻基因组数据库注释的Loc_Os03g63810基因的编码序列设计特异引物,用RT-PCR法从茉莉酸甲酯(MeJA)处理的水稻叶片中克隆WRKY80 cDNA序列,运用生物信息学手段对推定的蛋白和启动子序列进行分析,用Northern杂交或实时荧光定量PCR方法研究基因的表达模式。【结果】获得了WRKY80 cDNA序列,长1 392 bp,包含1个长1 164 bp的完整开放读码框,编码387个氨基酸。WRKY80具有1个典型的WRKY保守...

为揭示萌发期不同水稻的抗旱性机理，以水稻旱敏感材料(Calrose、京宁10号、山形86)和抗旱性材料(Farry、松粳3号、宁粳36)为研究对象，开展了模拟干旱胁迫(15%PEG-6000)对不同水稻萌发种子生长指标、生理指标及相应基因表达量的影响研究。结果表明：正常条件下，旱敏感和抗旱性材料萌发种子各生长指标、抗逆相关基因表达量之间无显著差异；但生理指标有明显变化，表现为不同材料间超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性、可溶性糖(SS)和过氧化氢(H_2O_2)含量无显著差异，旱敏感性材料山形86的丙二醛(MDA)、超氧阴离子(O_2~(-·))含量显著高于其他材料；抗旱性材料宁粳36的过氧化氢酶(CAT)活性、脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白(SP)含量显著高于其他材料。干旱胁迫下，相比于旱敏感性材料，抗旱性材料萌发种子的相对发芽势(RGP)、相对芽长(RSL)、萌发期抗旱指数(GDRI)和活力指数(VI)分别增加了0.03～0.07百分点，0.32～0.39百分点，0.12～0.18百分点和92.41%～108.39%;抗旱性材料萌发种子中MDA和活性氧(O_2~(-·)、H_2O_2)含量分别降低了2.54%～61.64%,19.60%～46.30%和35.61%～62.02%;渗透调节物质(Pro、SS、SP)含量分别增加了5.93%～18.29%,1.08%～7.97%和3.47%～6.03%;抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性分别提高17.29%～33.12%,15.24%～76.06%和14.68%～18.61%;脯氨酸合成关键基因OsP5CS、抗氧化酶合成基因(OsALM1、OsPOX1、OsCATC)的相对表达量分别上调了2.66%～182.31%,57.14%～513.27%,0.38%～109.06%和63.39%～184.25%。综合分析表明，干旱胁迫抑制了水稻种子的萌发，影响了萌发期种子中的生理特性及其相应基因的表达。干旱胁迫下，无论是抗旱性材料还是旱敏感性材料，活力指数(VI)、过氧化物酶(POD)以及过氧化物酶合成基因(OsPOX1)是影响水稻种子萌发的关键指标。除以上指标外，可溶性蛋白(SP)、脯氨酸合成基因(OsP5CS)、过氧化氢酶基因(OsCATC)是影响抗旱性材料的其他关键指标，相对芽长(RSL)、过氧化氢(H_2O_2)、超氧化物歧化酶基因(OsALM1)是影响旱敏感性材料的其他关键指标。

用白叶枯菌(HB84-17)、10μg·ml-1中生菌素和10μg·ml-1中生菌素+白叶枯菌处理水稻抗、感白叶枯病近等位基因系CBB4和沈农1033悬浮细胞,采用斑点杂交的方法研究了中生菌素对水稻悬浮细胞苯丙氨酸解氨酶基因转录表达的影响。结果表明,白叶枯菌、中生菌素和中生菌素+白叶枯菌处理都能诱导悬浮细胞中苯丙氨酸解氨酶基因的转录表达。对于CBB4,白叶枯菌处理3h时苯丙氨酸解氨酶基因开始诱导转录表达,6h达到高峰,诱导表达时间持续至48h;中生菌素处理3h时开始大量表达,大量表达持续至48h。对于沈农1033,白叶枯菌处理12h时苯丙氨酸解氨酶基因才开始诱导转录表达,诱导表达持续至24h;...

为研究水稻赤霉素20-氧化酶2(OsGA20ox2)基因的过量表达对水稻株高和生长发育的影响,通过RT-PCR扩增OsGA20ox2基因并构建该基因的过量表达载体pS12Q,采用农杆菌介导法遗传转化水稻,获得了高秆转基因植株。获得T0代的85株中,对其叶片基因组DNA进行Hyg基因扩增,发现其中2株为转基因植株且表现为高秆。分析其T2代表型,高秆植株与对照相比,株高增加9.41%(P<0.05);穗颈长增加15.62%(P<0.05);倒1节间长度增加8.46%(P<0.05);穗长增加7.98%(P<0.05);穗粒数增加6.8%(P<0.05);分蘖数增加了12.5%(P<0.05);百粒...

为了探究盐胁迫下不同抗性水稻氮代谢的变化,以抗性品种东稻4号、盐敏感品种日本晴为材料,测定NaCl胁迫下水稻根和叶中氮含量、氮代谢相关酶活及相关基因表达的变化。结果表明,0.3%的NaCl胁迫后水稻根和叶中NO~-_3含量、硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、依赖NADH的谷氨酸合酶(NADH-GOGAT)活性均有不同程度的下降,而NH~+_4含量、依赖Fd的谷氨酸合酶(Fd-GOGAT)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、天冬氨酸转氨酶(AST)活性均升高,东稻4号氮含量及氮代谢酶活性比日本晴稳定,根和叶中变化一致。检测氮转运及代谢相关基因表达发现,硝酸根转运蛋白基因OsNRT1;1、OsNRT1;5、OsNRT1;8、OsNRT2;1,铵转运蛋白基因OsAMT1;1、OsAMT1;2及谷氨酰胺合成酶基因OsGS1;2、天冬氨酸转氨酶基因OsAS盐胁迫后在2个品种中均升高,在高表达部位升高显著;谷氨酸合酶基因OsFd-GOGAT在两品种叶中升高显著,根中稍有下降;谷氨酸合酶基因OsNADH-GOGAT和谷氨酸脱氢酶基因OsGDH在日本晴根中升高显著,在叶中及东稻4号中升高但不显著。OsNR1在NaCl胁迫后两品种叶中表达量显著降低,根中无差异。东稻4号OsNRTs及氮代谢相关基因表达量总体上高于日本晴,而日本晴OsAMTs升高幅度大于东稻4号。研究表明,NaCl胁迫下,东稻4号相比日本晴更能保持氮代谢稳定性,这可能是水稻抗性品种耐盐的一个重要机制。

【目的】水稻中有近百个WRKY转录因子家族成员,其中很多与生长发育、生物与非生物逆境胁迫应答有关。河北农业大学生命科学学院分子生物学与生物信息学实验室(molecular biology&bioinformatics lab,MBB)前期发现OsWRKY68在水稻接种白叶枯病菌后诱导表达,本研究试图进一步探究OsWRKY68的功能。【方法】采集水稻TP309不同生长发育时期的组织样品,包括萌发期、幼苗期、分蘖期、孕穗期和开花期的根、茎、叶、叶鞘、叶枕、穗子、花药、颖壳和种子,以及非生物胁迫(4℃、44℃、48℃、淹、NaCl、PEG、恒光和恒暗)和激素处理(脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸和乙烯利)的叶片,提取总蛋白质,用水稻OsWRKY68蛋白质特异抗体,通过免疫印迹(western blot,WB)技术系统调查OsWRKY68蛋白质在水稻正常发育过程中不同时期、不同组织、非生物胁迫及激素处理条件下的表达特征。构建RNAi载体,通过农杆菌介导的方法转化水稻TP309,对转基因植株进行PCR和WB鉴定,观察OsWRKY68 RNAi转基因植株的表型并测量其株高、分蘖数、穗长、小穗数和结实率等性状。【结果】调查OsWRKY68蛋白质的表达丰度,发现OsWRKY68蛋白质在水稻正常生长发育过程中基本呈组成型表达,且在大部分组织中表达丰度差异倍数不大,但在开花期的花药中OsWRKY68表达量高于成熟穗、穗轴和颖壳;在分蘖期和孕穗期的叶鞘中不表达,仅在开花期的叶鞘中表达;在孕穗期的幼穗中,随着幼穗长度的增加其表达丰度逐渐降低。调查水稻非生物胁迫和激素处理后OsWRKY68蛋白质的表达特征,发现盐胁迫后OsWRKY68蛋白质的表达丰度随时间延长持续下降,恒光处理后OsWRKY68蛋白质表达量持续上升,3 d时明显出现一条分子质量较大的条带(记作OsWRKY68+),且表达量逐渐增加,茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)和乙烯利(ethephon,ET)处理后同样也呈现OsWRKY68+蛋白质丰度的增加。对转基因植株进行鉴定和自交繁殖,对T3代的4个OsWRKY68 RNAi转基因株系(Y316、Y317、Y326和Y337)进行PCR和WB鉴定,均表现阳性。在转基因植株中,OsWRKY68蛋白质的表达量均低于野生型TP309。对转基因植株进行表型观察和性状测量,发现与野生型相比转基因植株的株高降低、分蘖数和结实率下降等。【结论】OsWRKY68蛋白质在水稻正常生长发育中发挥作用,敲低OsWRKY68蛋白质的表达能影响水稻的正常生长。OsWRKY68蛋白质可能参与盐、光照、茉莉酸甲酯和乙烯介导的信号转导过程。

采用RT-PCR技术克隆了水稻O-甲基转移酶ZRP 4基因的cDNA片段,并进行了序列测定与分析。结果表明,该序列全长1 101 bp,编码366个氨基酸,与G enB ank中水稻ZRP 4基因序列比对,核苷酸同源性为99.8%,氨基酸同源性为99.7%。将克隆片段插入中间载体pBPFΩ7,经H indⅢ酶切回收带有P 35s启动子和nos终止子片段,连接pCAM B IA 1301载体,成功构建ZRP 4基因的植物表达载体。