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[期刊] 林业科学研究
[作者]
刘博文 王雪庆 孙涛 亓倩 于淑惠 杨璞 陈晓鸣
白蜡虫（ＥｒｉｃＥｒｕｓ ｐＥｌａ）是我国特有的资源昆虫，泌蜡是白蜡虫二龄雄虫最为特化的性状［１］。白蜡虫分泌的白蜡在食品、医药、纺织等行业具有重要的经济价值［２］。白蜡的主要成分是２６酸２６酯［３］，已有研究表明，蜡酯的生物合成在动植物中存在保守途径［４］。蜡酯生物合成的第一步由脂酰辅酶ａ还原酶催化脂酰辅酶ａ转化为脂肪醇，第二步由蜡酯合酶（Ｗｓ）催化脂肪醇和脂肪酸的酯化反应［５］。Ｗｓ
[期刊] 中国林业科学研究院
[作者]
孙涛
白蜡虫(Ericerus pela Chavannes)是我国具有重要经济价值的资源昆虫,其2龄雄幼虫所分泌的白蜡是一种天然高分子化合物,被广泛应用于机械、医疗、食品、化妆品等诸多领域。研究表明,不同生物体内存在保守的蜡酯合成途径,在不同生物中,蜡酯最终都是在蜡酯合酶(wax synthase,WS)的催化下由长链脂肪酸和长链脂肪醇通过酯化反应形成的,因此,WS是催化蜡酯合成最关键的酶。本研究在前期鉴定到白蜡虫ws基因的基础上,围绕基因表达动态、基因体内功能和体外活性,采用实时荧光定量PCR技术(Real
[期刊] 林业科学研究
[作者]
亓倩 于淑惠 孙涛 王雪庆 刘博文 杨璞 陈晓鸣
［目的］本研究欲利用Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ表达系统，在Ｓｆ９细胞中表达ＷＳ。［方法］将ＷＳ编码序列克隆到质粒ｐ ｆａＳｔＢａｃ～（ｔＭ）Ｈｔ Ｂ后，转化大肠杆菌ＤＨ１０Ｂａｃ～（ｔＭ），经抗性和蓝白斑筛选，获得重组杆粒ｒ ＢａｃＭｉＤ／ＥｐＥｌ ＷＳ。将ｒ ＢａｃＭｉＤ／ＥｐＥｌＷＳ转染Ｓｆ９细胞。［结果］免疫荧光标记检测表明：ＷＳ在受感染细胞的细胞质中表达。［结论］本研究成功表达了白蜡虫ＷＳ，为白蜡虫ＷＳ的生化特性研究奠定了基础。
[期刊] 林业科学
[作者]
谢树章 秦平伟 张迷 胡雨晴 李名扬 眭顺照
在构建好蜡梅花cDNA文库并进行EST分析基础上,通过随机克隆测序,得到1个蜡梅几丁质酶的cDNA基因,命名为Cpchia(GenBank登录号:FJ749130)。CpchiacDNA全长为1184bp,开放阅读框为954bp,编码317个氨基酸,其结构包括信号肽、几丁质结合域、可变交联区、催化区,无C端延伸区,为ClassⅠb型胞外几丁质酶,属于几丁质酶第19家族。将Cpchia克隆到原核表达载体pET-28a(+),在大肠杆菌BL2l细胞中以包涵体形式表达融合蛋白,利用透析法获得复性蛋白,其几丁质酶活性经DNS法检测达到200U.mL-1。酶活性和稳定性分析表明,试验条件下,pH7.0有...
关键词：
几丁质酶 克隆 原核表达 蜡梅
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
付洪冰 崔莹 崔崇士
从贝达葡萄中提取总RNA,采用RT-PCR方法,克隆到了白藜芦醇合酶(resveratrol synthase,RS)基因的全长cDNA。将其与圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)、华东葡萄(Vitis pseudoreticulata)、河南毛葡萄(Vitis ficifolia)、河岸葡萄(Vitis vulpine)、酿酒葡萄(Vitis virufera)、羊蹄甲(Bauhinia)、花生(Arachis hvpogaea)、虎杖(Polygonum cuspiaatum)、大黄(Rheum officinale)进行氨基酸同源性比对,结果表明:分离的RS基因与其他葡萄的R...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
卢金凤 梁高峰 梁艳 黄倢
本研究采用RACE方法克隆了中国对虾Fenneropenaeus chinensis Rab 7基因(fcrab7)全长cDNA(GenBank:JF742050)。生物信息学分析显示,fcrab7的开放阅读框615bp,编码205个氨基酸,分子量23.2kD。FcRab7的氨基酸序列具有Rab蛋白家族的共同特征,与凡纳滨对虾和斑节对虾同源蛋白的同源性为100%。构建重组表达载体pBAD/gIIIA-fcrab7转化到大肠杆菌E.co-li进行诱导表达,诱导产物经SDS-PAGE检测和Westernblot验证。本研究结果为进一步研究WSSV与FcRab7的相互作用提供了基础。
关键词：
中国对虾 fcrab7 克隆 原核表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘小民 李杰 郭巍 张霞 李新娜
【目的】克隆棉铃虫中肠羧酸酯酶基因,了解该酶的分子特性,为研究棉铃虫抗药性机理奠定基础。【方法】制备抗血清,对棉铃虫(Helicoverpa armigera(Hübner))中肠cDNA表达文库进行免疫筛选,得到编码棉铃虫羧酸酯酶基因的cDNA克隆,利用生物信息学软件和网站进行序列分析,构建原核表达载体进行表达,并以α-醋酸萘酯溶液为底物进行活性测定。【结果】测序分析表明,羧酸酯酶基因hc3(GenBank登录号:GU119888)全长2 896 bp,编码795个氨基酸。羧酸酯酶HC3的等电点pI为3.94,活性中心包括3个氨基酸残基(催化三联体):Ser204,Glu331,His444...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
周晓卉 黄丽华 蒋向 李育强 张学文
【目的】揭示棉田杂草薤白(Allium macrostemon Bunge)抗草甘膦的分子机理,开发利用其草甘膦抗性特性。【方法】运用RT-PCR结合RACE技术,分离克隆了薤白中草甘膦作用的靶酶EPSP合成酶(EPSPs)基因cDNA,并将其构建成原核表达载体在大肠杆菌中诱导表达和鉴定其抗性。【结果】薤白EPSP合成酶基因cDNA序列全长1821bp,编码一段522个氨基酸的推导蛋白质。经BLAST及蛋白质结构预测,蛋白具有EPSPs的特征序列,并与已报道的EPSPs序列有高同源性,确认克隆的cDNA序列即是薤白EPSPs基因序列,命名为EPSPsA。将该cDNA与原核表达载体pRSET-A...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
蒋霞云 袁襄南 魏福卫 周培根 邹曙明
采用快速扩增cDNA末端(RACE)克隆技术,通过设计甲壳素脱乙酰酶简并引物,从总状毛霉(Mucor racemosus)菌丝体中克隆了CDA2的基因(EF468349)及其全长cDNA(DQ678929)序列。与已获得的总状毛霉菌cda1基因相比,cda2基因中不含内含子。总状毛霉cda2全长cDNA为1 378 bp,包含23 bp 5’端非翻译区、1 254 bp开放阅读框和101 bp 3’端非翻译区,编码一条由418个氨基酸残基组成的多肽链,其N端包含一段21个氨基酸残基组成的信号肽,在150～272氨基酸残基区存在一个多糖脱乙酰酶保守结构域。通过构建pET28a-cda2表达载体和...
[期刊] 林业科学研究
[作者]
杨璞 陈晓鸣 朱家颖 丁伟峰 刘魏魏
采用RACE和RT-PCR对白蜡虫雌成虫β1-微管蛋白基因进行了克隆,获得的cDNA全长序列为1 492 bp,完整开放阅读框为1 341 bp,编码447个氨基酸残基,包含β微管蛋白的保守区域和GTP结合位点,理论分子量约为50.20 Kda,等电点为4.75。同源性分析表明:所获得的β1-微管蛋白与其它昆虫的β微管蛋白基因在氨基酸水平上是高度同源的,该基因cDNA序列已经递交到Genbank,获得的登录号为JF731244。
关键词：
白蜡虫 微管蛋白 RACE 氨基酸
[期刊] 中国水产科学
[作者]
孙晶 李广丽 朱春华 吴天利 邓思平
采用RT-PCR和RACE法,克隆了胡子鲇(Clarias fuscus)脑型芳香化酶基因Cyp19a1b,应用荧光实时定量PCR检测其在前脑、下丘脑、脑垂体、肝、精巢和卵巢6种组织,以及性腺分化前后(出膜后12～30 d)全鱼中的mRNA表达。结果表明,Cyp19a1b cDNA全长2 347 bp,5′端非编码区219 bp,3′端[不包括poly(A)]596 bp,开放阅读框(ORF)1 503 bp,编码500个氨基酸,推测其编码蛋白质分子量为56.388 kD。序列分析及分子系统进化树结果表明,胡子鲇Cyp19a1b氨基酸序列与非洲鲇(Clarias gariepinus)Cyp1...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘秀明 杨文婷 张雪萌 焦重达 姚娜 杨美英 官丽莉 李海燕 李校堃
【目的】克隆红花(Carthamus tinctorius L.)黄酮合成途径中的关键酶查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因的全长序列,研究其组织表达特异性,为红花代谢调控研究提供参考。【方法】利用RT-PCR技术克隆CHI基因的cDNA全长,并对其全长基因进行生物信息学分析;构建系统发育树,研究其与相似序列的同源性;利用实时荧光定量PCR方法,分析CHI基因在红花不同开花时期的表达量。【结果】CHI基因全长1 161bp,开放阅读框长654bp,编码217个氨基酸,理论分子质量约为23.14ku,等电点为5.67,序列含有典型的加尾信号序列AATAA和Poly(A...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王金苹 赵俊龙 江涛 周艳琴 刘琴 付媛 姚宝安
利用PCR技术从弓形虫RH株基因组中扩增出SAGⅠ部分基因片段,亚克隆入表达载体pGEX-KG,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳显示表达的重组蛋白的分子量为56ku。免疫印记分析显示此表达产物能被猪抗弓形虫阳性血清所识别,表明该重组蛋白具有免疫反应活性。为进一步进行弓形虫病的免疫预防和诊断研究奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
胡薇 刘宁 田玉华 李雨婷 张连学
【目的】克隆人参皂苷生物合成途径中的鲨烯环氧酶(SQE)基因,并进行原核表达与纯化,初步探讨SQE活性与人参皂苷生成量之间的关系。【方法】以4年生人参根组织须根为材料,提取其总RNA,反转录为cD-NA。以合成的cDNA为模板,对SQE基因进行克隆,再将其插入原核表达载体pET-30a中,构建pET-30a-SQE重组质粒,经酶切和测序鉴定后,转入Rosetta大肠杆菌,经0.8mmol/L IPTG 37℃诱导表达4h后,进行SDS-PAGE电泳检测,采用Ni-Agarose亲和层析柱纯化目的蛋白,利用液相色谱-串联质谱联用技术(LC-MS)检测SQE的活性。【结果】获得了人参SQE基因1 ...
关键词：
人参 鲨烯环氧酶 cDNA克隆 原核表达
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
谢丽雪 黄科 李宾 黄志伟 郑金贵
根据GenBank上已公布的植物黑芥子酶基因序列设计引物,采用RT-PCR和3′/5′-RACE相结合的方法,从芥蓝中克隆出黑芥子酶基因全长cDNA序列.序列全长为1832 bp,开放阅读框为1647 bp,编码549个氨基酸,含有糖基水解酶家族Ⅰ(Glyco_hydro_1)活性位点,GenBank登录号为DQ767973.该核苷酸序列与十字花科其他植物的黑芥子酶基因序列具有较高的同源性,同油菜、萝卜、芥菜和大白菜的同源性达90%以上.利用pET28-α(+)构建芥蓝黑芥子酶基因的原核表达载体,转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表明表达蛋白的分子质量约为65 ku...
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