【目的】研究白蜡窄吉丁气味结合蛋白AplaOBP2在触角中的表达定位,解析AplaOBP2重组蛋白的配体结合特性及配体活性,旨在通过气味结合蛋白筛选白蜡窄吉丁新的信息化合物。【方法】原核表达白蜡窄吉丁气味结合蛋白AplaOBP2,采用免疫组织化学技术研究AplaOBP2在白蜡窄吉丁触角中的表达定位,通过荧光竞争结合试验分析AplaOBP2重组蛋白与58种化合物的结合特性,并进一步通过触角电位仪和"Y"型嗅觉仪测定AplaOBP2的配体对白蜡窄吉丁成虫的活性。【结果】在原核表达系统中成功表达AplaOBP2重组蛋白。免疫定位结果显示AplaOBP2在触角嗅觉感器——锥形感器Ⅰ的淋巴液表达。荧光竞争结合试验结果表明,AplaOBP2蛋白能够与反-2-己烯醛、反-2-庚烯醛、苯甲醛、4′-乙基苯乙酮、3′,4′-二甲氧基苯乙酮和β-紫罗兰酮6种配体结合,其解离常数KD值分别为4.44,4.17,5.20,2.91,3.45和0.63μmol·L-1。白蜡窄吉丁雌雄成虫对10 mg·mL~(-1)的6种配体均有触角电位反应。行为学试验表明,在10 mg·mL~(-1)刺激剂量条件下,反-2-己烯醛对雌成虫有显著引诱作用,β-紫罗兰酮对雌虫表现出明显的趋避作用。【结论】白蜡窄吉丁气味结合蛋白AplaOBP2在嗅觉感器表达,能够选择性结合醛类和酮类物质,推测其在嗅觉识别中发挥功能。气味结合蛋白可作为靶蛋白,鉴定对白蜡窄吉丁具有吸引或趋避活性的信息化合物。

【目的】比较荧光竞争结合试验(fluorescence competitive binding assay)和微量热涌动(microscale thermophoresis,MST)技术在研究绿盲蝽(Apolygus lucorum)气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)Aluc OBP21配体结合特性上的差异,探索一种新的测定昆虫OBPs结合功能的方法。【方法】提取绿盲蝽雌、雄成虫触角总RNA并进行反转录,获得绿盲蝽成虫触角c DNA。采用特异性克隆引物,以绿盲蝽成虫

【目的】通过测定李小食心虫（Grapholita funebrana）Plus-C气味结合蛋白2(odorant binding protein,GfunOBP2)结合性信息素和苹果树挥发化合物的能力，分析GfunOBP2的嗅觉功能，为阐释李小食心虫定位寄主植物的嗅觉分子机理打下基础。【方法】利用RT-PCR扩增GfunOBP2的ORF序列，通过同源注释和比对氨基酸序列中半胱氨酸（Cys）的分布模式确定GfunOBP2属于Plus-C OBP亚家族；利用RT-qPCR检测GfunOBP2在李小食心虫3日龄成虫触角、头、胸、足、翅、腹部和性腺中的相对表达量；构建pET30a(+)/GfunOBP2原核表达载体，在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)细胞中表达GfunOBP2重组蛋白。利用荧光竞争结合试验测定重组GfunOBP2蛋白对5种性信息素和35种苹果树挥发化合物的结合能力；通过分子对接预测GfunOBP2与具有强结合能力的气味配体的相互作用力及关键氨基酸残基。【结果】克隆获得GfunOBP2(GenBank登录号：OQ054799.1)的全长序列，共编码183个氨基酸，氨基酸序列中有12个保守的Cys，其分布模式表明GfunOBP2属于Plus-C OBP。GfunOBP2主要在成虫触角中表达，在雄虫触角中的相对表达量显著高于雌虫触角（P

【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)寄生在牛羊等反刍动物的皱胃中,引起的捻转血矛线虫病在我国呈全国性流行。文章通过研究脂肪酸与视黄醇结合相关蛋白Hc-FAR-4的表达特性及配体结合能力,以了解其在捻转血矛线虫生长、发育、繁殖过程中的作用。【方法】对Hc-far-4进行克隆、并且构建原核表达载体p ET-30a-Hc-far-4,p ET-30a-Hc-far-4重组质粒经过PCR与双酶切鉴定准确无误之后转化到E. coli BL21感受态细胞中,用0.1 mmol·L~(-1) IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)进行重组蛋白的诱导表达。收集重组蛋白r Hc-FAR-4,利用荧光分析法,研究r Hc-FAR-4蛋白与DAUDA、视黄醇、油酸的结合能力。配体结合试验是依据荧光物质retinol与脂肪酸类似物DAUDA在极性和非极性溶液中,在某一波长的激发光激发下,所发出的荧光光谱随之变化的特性,判断r Hc-FAR-4蛋白是否具有与DAUDA、retinol结合的能力。再在体系中加入非荧光长链脂肪酸油酸,根据荧光光谱的变化情况判定油酸能否分别与DAUDA、retinol竞争目的蛋白的脂肪酸结合位点,间接说明目的蛋白能否与非荧光脂肪酸油酸结合。同时制备鼠源多克隆抗体,利用ELISA技术检验免疫后小鼠的抗体效价,抗体效价合适即可收集小鼠血清。收集的血清用于免疫组织荧光(IHF)试验,探究Hc-FAR-4的表达部位,从而推测其功能。该试验过程为:对捻转血矛线虫进行石蜡包埋,石蜡切片,抗原修复,3%的BSA于4℃封闭过夜,自制鼠源多克隆抗体作为一抗孵育1 h; Alexa Fluor?488 nm羊抗鼠Ig G作为二抗避光孵育1 h,DAPI染色30 min,激光共聚焦显微镜检查染色情况。利用荧光定量PCR技术分析Hc-far-4在捻转血矛线虫各个主要阶段的表达特性。【结果】成功克隆目的基因Hc-far-4,测序结果与Sanger数据库中捻转血矛线虫far-4基因序列(>HCISE00908800.t1)相似度为99.9%;重组质粒p ET-30a-Hc-far-4在E. coli BL21中成功表达,在诱导8 h后达到峰值。经过ELISA检测,结果显示制备的鼠源多克隆抗体效价达到1﹕1 024 000—1﹕2 048 000,可用于后续试验。Western Blot鉴定结果显示r Hc-FAR-4重组蛋白带有His标签,并且条带大小为25 k D,结果符合预期。制备的鼠源多克隆抗体经过Western Blot鉴定,能够与天然Hc-FAR-4蛋白结合,说明该抗体可用于IHF试验。配体结合试验结果表明r Hc-FAR-4蛋白具有结合脂肪酸与视黄醇的能力。荧光定量PCR分析表明,Hc-far-4在四期幼虫中的转录水平最高;IHF试验表明,Hc-FAR-4主要表达在捻转血矛线虫的肠壁、性腺中。综上推测Hc-FAR-4蛋白主要在寄生生活阶段参与了转运脂肪酸与视黄醇,为捻转血矛线虫的生长发育与生殖提供营养物质。【结论】捻转血矛线虫FAR-4蛋白能够结合脂肪酸类似物DAUDA和视黄醇,但是与油酸的结合能力较弱,主要表达在肠壁,在性腺、角皮中也有少量表达,其基因在进行营寄生生活阶段时表达量达到峰值。

利用原核细胞表达羊口蹄疫病毒(FMDV)受体整联蛋白β6亚基的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白。以含有羊整联蛋白β6亚基全长cDNA的质粒为模板,PCR扩增得到β6LBD基因片段,经酶切消化处理后与同样酶切处理的原核表达载体pPROEXTMHTb相连,构建原核表达质粒pPRO/β6LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导表达重组羊β6LBD融合蛋白。SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达并利用镍离子亲和树脂对其纯化,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot方法分析鉴定表达产物。成功构建了pPRO/β6LBD原核表达载体,实现了羊...

【目的】利用昆虫的嗅觉识别机制,以化学感受蛋白作为潜在的靶标,干扰昆虫的寄主定位及交配等行为,用于害虫综合治理。【方法】克隆并纯化了1个新的苜蓿盲蝽化学感受蛋白Alin-CSP6,进行了113种气味化合物对Alin-CSP6的荧光竞争性结合试验,将荧光竞争结合试验筛选出强结合力的气味标样采用"Y"型嗅觉仪验证行为反应,并采用同源建模的方法构建Alin-CSP6的3D结构。【结果】Alin-CSP6具有较广谱的结合力,能够与醇、醛、酮、酯、萜、芳香族等多种化合物结合并表现较强的结合能力。其中,β-香茅醇(β-citronellol)、反式-2-己烯醛(trans-2-hexene aldehyd...

【目的】中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）是我国本土蜂种，也是重要的传粉昆虫和经济昆虫。气味结合蛋白（odorant binding protein,OBP）是蜜蜂嗅觉感知中的关键蛋白。在前人对中蜂AcerOBP7基因序列特征分析的基础上，本研究进一步对其表达特性及与气味物质的结合能力进行探究，为揭示气味结合蛋白在中蜂嗅觉系统中的作用提供基础数据。【方法】采用qRT-PCR检测AcerOBP7在工蜂不同组织和发育阶段的表达特性；通过原核表达系统获得AcerOBP7融合蛋白，使用Ni-NTA柱进行蛋白纯化；采用荧光竞争结合法，以1-NPN(N-phenyl-1-naphthylamine)为荧光探针，测定AcerOBP7与信息素及植物挥发物的结合能力；设计并合成ds AcerOBP7，采用饲喂法对该基因进行沉默，通过qRT-PCR测定沉默效率；结合RNAi，利用EAG检测并比较对照组与干扰组中蜜蜂触角对待测物质反应值的差异。【结果】qRT-PCR结果显示，AcerOBP7mRNA在工蜂触角中的表达量极显著高于其他组织（P<0.05）。【结论】AcerOBP7在中蜂采集蜂触角中高表达，重组蛋白能与多种气味分子结合，表明AcerOBP7是一种广谱型结合蛋白，推测其可能在工蜂采集和哺育蜂王的行为中发挥着重要作用。另外，1-辛烯-3-醇、壬醛、桉树脑和9-ODA可能是AcerOBP7结合特异性较高的配体物质。

[目的]本文旨在鉴定重要农业害虫斜纹夜蛾(Spodoptera litura)气味结合蛋白基因GOBP2的顺式作用元件,为揭示GOBP2的转录调控机制和开发基于嗅觉干扰的害虫防治技术奠定基础。[方法]利用5′RACE技术克隆GOBP2的5′UTR,确定转录起始位点;利用染色体步移技术(chromosome walking)克隆GOBP2的5′侧翼区,并利用在线网站预测转录因子结合位点;利用PCR克隆GOBP2的5′侧翼区逐步缺失片段,并构建到pGL3-Basic载体上;将各重组载体分别转染Sf9细胞,48 h后收获细胞并利用双荧光素酶报告系统检测转录活性。[结果]获得斜纹夜蛾GOBP2长23 bp的5′UTR,由此确定GOBP2的转录起始位点。通过染色体步移获得斜纹夜蛾GOBP2的5′端调控区2 025 bp的序列,发现启动子的典型TATA框;针对-1 000 bp序列的转录活性分析表明,最强转录活性区域位于-243～-207 bp,具有1个增强子;此外,在-971～-891 bp及-890～-811 bp各有1个增强子,在-244～-315 bp存在1个沉默子。[结论]获得斜纹夜蛾GOBP2的转录起始位点及顺式作用元件,为进一步研究GOBP2的转录调控机制奠定了基础。

【目的】研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana)体外重组普通气味结合蛋白AcerASP2与不同气味信息的结合功能和模式。【方法】通过诱导条件的优化和纯化,在获得的重组AcerASP2蛋白基础上,研究竞争性荧光探针1-NPN及不同结构气味信息与蛋白的相互作用关系,并通过同源建模和分子对接解析蛋白与气味信息的结合模式和机理。【结果】通过条件摸索获得了可溶性表达的重组中蜂ASP2蛋白,荧光光谱分析1-NPN与AcerASP2的解离常数K1-NPN为7.38μmol.L-1,结合位点数n为1.0321。在7种气味信息中,4-烯丙基藜芦醚亲和力最强,其IC50和解离常数KD分别达到7.09和...

【目的】松针鞘瘿蚊是近几年新发现入侵我国的林业有害生物,已经在山东省青岛市黄岛区造成了以黑松为主的沿海防护林大面积衰弱枯死。作为新入侵种对于松针鞘瘿蚊的防控基础研究极为薄弱,为了研发有效的防控技术,尽快遏制该虫的严重危害,避免进一步扩散,本文从松针鞘瘿蚊的寄主识别机制出发,以期开发针对性的引诱剂来进行监测诱杀。【方法】本研究基于松针鞘瘿蚊触角转录组数据筛选到的气味结合蛋白TjapOBP1的序列,通过同源模建的方法,得到了蛋白三维结构模型,利用Procheck、Verify_3D和ERRAT程序评估模型的可靠性。通过AutoDock软件将TjapOBP1与黑松针叶挥发物中测得的67种气味分子进行分子对接。【结果】同源模建结果显示,模建蛋白的氨基酸有95.5%落在最佳合理区,83.3%的氨基酸评分大于0.2,模建结构的误差值在73.2%,这表明此次构建的松针鞘瘿蚊气味结合蛋白TjapOBP1三维模型有很高的可靠性。分子对接结果显示,β-月桂烯与TjapOBP1的结合效果最好,结合能为-5.26;另外,2,6-二甲基辛-1,5,7-三烯-3-醇、乙酸橙花酯、桧烯、乙酸薰衣草酯和1-异丙基-4-亚甲基二环[3.1.0]己-2-烯,这5种化合物与TjapOBP1的结合能依次升高,但均在-5.0以下。上述6种化学物质均有可能是能够被松针鞘瘿蚊TjapOBP1识别并结合的气味物质。【结论】三维结构模型的构建,为进一步研究松针鞘瘿蚊OBP的功能奠定基础。分子对接初步筛选了可能与TjapOBP1特异性结合的寄主挥发物,从而为引诱剂的开发提供支撑。

【目的】沙葱萤叶甲(Galeruca daurica)是近年来在内蒙古草原上暴发成灾的新害虫,本文旨在克隆沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20的cDNA全长序列,明确其重组蛋白与寄主植物挥发物的结合特性,为揭示沙葱萤叶甲嗅觉的分子机理打下基础。【方法】基于沙葱萤叶甲转录组数据,利用RACE技术对沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20进行cDNA全长克隆;利用生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;通过原核表达系统表达目的蛋白,并使用Ni-NTA Agarose亲和层析柱进行重组蛋白纯化。最后采用荧光竞争结合的方法,以N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)为荧光探针,检测GdauOBP20重组蛋白与13种主要寄主挥发物的结合情况。【结果】GdauOBP20的cDNA全长序列为567 bp(GenBank登录号MK250532),其中5′末端非编码区长24 bp,3′末端非编码区长123 bp,具有ployA尾结构;开放阅读框(ORF)全长为420 bp,编码139个氨基酸。氨基酸序列中含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-C OBP亚家族。预测蛋白三级结构中含有6个α螺旋和两对由半胱氨酸形成的二硫键。成功构建了重组表达载体并获得了高纯度的重组蛋白。重组蛋白GdauOBP20与荧光探针1-NPN的结合常数为12.8μmol·L-1,结合能力较好,可作为本试验的荧光报告子。在所测的13种主要寄主植物挥发物中,除与二烯丙基三硫醚无结合能力外,GdauOBP20重组蛋白与其他12种寄主植物挥发物均有不同程度的结合能力,其中与对二甲苯和环庚三烯的结合能力最强,解离常数分别为22.91和26.55μmol·L-1,而与月桂烯结合能力最弱,解离常数为116.29μmol·L-1。【结论】沙葱萤叶甲GdauOBP20能与寄主植物的多种主要挥发性物质结合,推测其可能在沙葱萤叶甲对寄主植物的定位过程中发挥重要的作用。

【目的】克隆梨小食心虫（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ ｍｏｌｅｓｔａ）普通气味结合蛋白２（ＧｍｏｌＧｏＢｐ２）的全长ｃＤＮａ序列并进行原核表达，为研究该蛋白在梨小食心虫化学感受系统中的作用奠定基础。【方法】利用ｒｔ－ｐｃｒ和ｒａｃｅ技术克隆ＧｍｏｌＧｏＢｐ２的全长ｃＤＮａ序列，并使用原核表达载体ｐｅｔ－３２ａ在大肠杆菌Ｂｌ２１（Ｄｅ３）中进行表达，用ｓＤｓｐａＧｅ和ＷｅｓｔｅｒＮ Ｂｌｏｔ检测其表达情况。【结果】ＧｍｏｌＧｏＢｐ２的ｃＤＮａ全长序列为６３７Ｂｐ（ＧｅＮＢａＮｋ登录号：ＪＮ８５７９４０），开放性阅读框长度为４８３Ｂｐ，编码１６１个氨基酸残基，成熟蛋白分子质量为１５．９８ｋｕ，等电点为４．．．．

【目的】克隆南瓜实蝇(Bactrocera tau)的气味结合蛋白(odorent binding proteins, OBPs)基因,并分析其相关生物学信息,为了解南瓜实蝇的嗅觉机制提供参考。【方法】基于南瓜实蝇转录组测序结果筛选获得OBPs基因并进行生物信息学分析,通过基因克隆测序验证鉴定OBPs基因,并采用sqRT-PCR检测OBPs在雌、雄虫不同组织中的分布情况。【结果】经PCR产物测序验证和BLAST比对后共鉴定得到6个南瓜实蝇OBPs基因,序列长度在498～955 bp,编码128～314 aa,预测分子量大小为14.67～36.24 kDa,等电点为4.69～8.16,且每个OBP序列的N端均具有16～26 aa组成的信号肽序列,属于1个Minus型和5个Classic型。不同类型的OBPs均具有各自典型保守的Cys位点。6个OBPs分化明显,序列相似度在30%～51%。系统进化树表明,6个OBPs与瓜实蝇(Zeugodacus cucurbitae)的OBPs亲缘关系较近,柑橘大实蝇(Bactrocera minax)次之。半定量RT-PCR检测显示,6个OBPs在雌、雄虫不同组织中均有表达,而OBP14在雄虫腹部不表达,OBP15在雌虫腹部不表达。【结论】上述研究结果为进一步研究南瓜实蝇嗅觉识别分子机制和引诱机制奠定了基础。

【目的】克隆与鉴定美洲斑潜蝇(Liriomyza sativae)气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因,并对其序列特征、表达情况、系统发育及蛋白功能进行研究,为深入研究美洲斑潜蝇嗅觉机制提供依据。【方法】通过PCR技术克隆美洲斑潜蝇OBP13编码区全长,用DNAMAN对其进行序列分析,用BLAST进行同源性比较,并使用MEGA6.0构建进化树,进行系统发育分析。通过实时定量PCR对OBP13在美洲斑潜蝇不同组织中的表达情况进行分析。构建原核表达载体,进行原核表达及蛋白

【目的】克隆、分析和原核表达编码中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2的cDNA。【方法】以13个不同日龄中华蜜蜂工蜂触角为材料,通过RT-PCR技术以获得编码中华蜜蜂Apis cerana cerana气味结合蛋白ASP2基因成熟蛋白开放阅读框序列,并在pET-30a(+)/BL21(DE3)系统中进行原核表达。【结果】克隆了命名为Acer-ASP2(GenBank登录号:DQ449667)的中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2基因,该序列全长429bp,编码142个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为15.7kD和4.36。预测蛋白具有昆虫气味结合蛋白典型的6个保守的半胱氨酸残基的特征,进一步分析表明Ace...