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[期刊] 西南农业学报
[作者]
杨馥睿 翟利佳 刘自刚 武泽峰 崔俊美 魏家萍 王小霞 巩永杰 王莹 方彦
【目的】: 探究白菜型冬油菜(Brassica rapa L．)脂肪酸去饱和酶ADS2(△9 fatty acid desaturase) 基因与抗寒性的关系。【方法】基于前期转录组结果，采用一步定向克隆法得到BrADS2基因；构建GFP融合表达载体，通过注射法在烟草下表皮细胞进行瞬时转化，同时采用农杆菌侵染法侵染‘中双11号’；利用qRT-PCR技术，检测抗寒性不同的白菜型冬油菜品种叶片中ADS2基因的表达模式，并对低温下冬油菜的形态变化和抗氧化酶活性、电导率含量进行分析。【结果】白菜型冬油菜BrADS2基因可编码307个氨基酸，该基因编码的蛋白具有亲水性特性；qRT-PCR结果显示，BrADS2基因的表达量呈先升后降的单峰型变化，且在-4 ℃时表达量达到峰值；亚细胞定位结果显示BrADS2蛋白在细胞质和细胞膜上表达；低温处理下3个品种叶片的相对电导率、抗氧化物酶活性均显著上升，强抗寒品种抗氧化酶活性高于弱抗寒品种，电导率却相反；农杆菌介导侵染‘中双11号’下胚轴后获得15株转基因阳性苗，且转基因油菜阳性植株叶中的BrADS2基因表达量均显著高于野生型。【结论】推测BrADS2基因在白菜型冬油菜膜脂不饱和调节中起重要作用，揭示了ADS2基因与冬油菜抗低温胁迫的关系。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李萍 聂亭亭 张腾国 郑晟 王娟 毛玉珊
【目的】克隆白菜型油菜‘陇油6号’MPK12基因的全长cDNA序列,研究其组织表达特异性,分析MPK12基因在低温、盐、ABA和H_2O_2处理下的表达情况,以阐明MPK12基因在油菜中的生物学功能。【方法】利用RACE技术克隆MPK12基因cDNA全长,并对其全长基因进行生物信息学分析;构建系统发育树,研究其与相似序列的同源性;利用实时荧光定量PCR方法,分析MPK12基因的组织表达特异性以及在低温、盐、ABA和H_2O_2逆境胁迫下的表达情况。【结果】油菜MPK12基因cDNA全长1 395bp,包括
[期刊] 中国农业科学
[作者]
曾秀存 孙万仓 孙佳 许耀照 方彦 史鹏辉 杨刚 孔德晶 武军艳 刘自刚
【目的】了解SOD酶蛋白家族Fe-SOD在超强抗寒冬油菜中的表达情况及其在低温胁迫下的作用。【方法】采用RT-PCR技术克隆超强抗寒白菜型冬油菜陇油7号Fe-SOD的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用半定量以及相对定量RT-PCR研究Fe-SOD在低温胁迫下的表达模式,采用氮蓝四唑(NBT)光还原法测定冬油菜叶片和根中的总SOD酶活性。【结果】获得Fe-SOD,GenBank登录号为KF178713,该基因cDNA片段全长645 bp,包含一个639 bp完整的开放阅读框,编码212个氨基酸的蛋白质,与白菜(Chiifu)的蛋白质氨基酸序列同源性高达99%。该基因编码的酶蛋白是1个...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
屠煦童 张仕杰 陈小云 李宁宁 辛璐 薛晓晖 章镇 渠慎春
【目的】从地方矮化品种‘南通小方柿’(Diospyros kaki Linn.cv.Nantongxiaofangshi)中分离赤霉素合成关键酶基因GA2ox,并进行亚细胞定位及表达分析,为进一步探索其矮生性状形成机理及选育新型矮生品种奠定基础。【方法】以‘南通小方柿’幼嫩叶片为材料,通过改良的CTAB法提取总RNA,利用简并引物克隆GA2ox家族中2个基因的片段,采用3′和5′RACE方法得到基因的全长c DNA序列,分别命名为Dk GA2ox1和Dk GA2ox2。通过生物信息学方法分析结构特征,利用GFP进行亚细胞定位,实时荧光定量RT-PCR技术研究其在发芽期、展叶期、枯顶期、开花期、...
[期刊] 草业科学
[作者]
姜红岩 张蕊 滕珂 檀鹏辉 刘凌云 尹淑霞
NAC(NAM, ATAF1/2, CUC2)是植物所特有的最大的转录因子家族之一,在调控植物生长发育、响应非生物胁迫等方面发挥着重要作用。本研究利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)从日本结缕草(Zoysia japonica)中克隆获得了ZjNAC2基因(GenBank登录号为MH580281),其编码区序列长1 110 bp,编码369个氨基酸。保守结构域分析显示,ZjNAC2编码蛋白在N端有一个典型的NAM结构域,表明ZjNAC2属于NAC转录因子家族。同时通过染色体步移的方法获得其启动子序列1 574 bp,通过作用元件分析发现该启动子上有ABA、非生物胁迫等多个不同的响应元件。亚细胞定位结果显示,ZjNAC2定位于细胞核。荧光定量分析表明,ZjNAC2在根中的表达量最高,并且在衰老叶片中表达量显著高于幼嫩叶片;此外ZjNAC2的表达受200μmol·L(–1) ET、10μmol·L(–1)MeJA、10μmol·L(–1) ABA和20%PEG4000的抑制,但受300 mmol·L(–1) NaCl处理的诱导。本研究表明ZjNAC2转录因子可能参与多种信号转导途径,这为进一步深入研究ZjNAC2的功能奠定了基础。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
蒋大华 张茹佳 张昌伟 侯喜林
[目的]本文旨在克隆不结球白菜BcATPA(ATPase alpha subunit)基因并研究其功能及其在不育系和可育系中的表达差异。[方法]构建BcATPA重组质粒,在NCBI数据库进行核苷酸序列分析,得到不结球白菜ATPA基因全长序列。利用实时定量PCR技术检测BcATPA基因在不结球白菜保持系和不育系的不同组织和器官及不同小孢子发育时期的时空表达情况。[结果]获得了不结球白菜ATPA基因全长序列,命名为BcATPA。该基因的核苷酸序列全长为1 806 bp,其最大开放阅读框长度为1 527 bp,编码508个包含F1-ATP酶α亚基保守区域的氨基酸,并且含有ATP结合、walker A motif和walker B motif等位点,而且在287～315的位置含有29个氨基酸的跨膜区域。BcATPA与芸薹属中的芥菜、甘蓝型油菜和拟南芥亲缘关系特别近,二级结构和三级结构预测表明,该基因与ATP结合有关。实时荧光定量PCR结果表明,BcATPA在不育系中的表达水平高于保持系,在花瓣、萼片中表达水平较高。在整个小孢子发育时期,不育系中BcATPA基因表达量逐渐降低;而在保持系中,从四分体时期开始显著下降,因此不育系与保持系表达量差异逐渐加大。[结论]BcATPA基因在不结球白菜不育系和保持系的各个器官和整个小孢子发育时期的表达水平存在差异,研究结果为进一步研究BcATPA基因与细胞质雄性不育之间的关系提供了理论依据。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王西成 王晨 房经贵 孙欣 冷翔鹏
以‘藤稔’葡萄(Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujiminori’)的花序、叶片和果实为试材,利用RT-PCR结合RACE技术,成功克隆了葡萄VvGA2ox1基因的cDNA序列,全长1 331 bp,共编码332个氨基酸。该基因在GenBank数据库的登录号为JQ608472。序列比对结果表明:VvGA2ox1与矮牵牛和棉花同源基因的氨基酸序列相似度分别为71.26%和71.08%。进一步构建了VvGA2ox1的亚细胞定位表达载体,定位结果显示,VvGA2ox1蛋白定位于细胞膜上。半定量RT-PCR与定量RT-PCR结果均表明,VvGA2ox1在葡萄花序、叶片和果实等器...
[期刊] 华北农学报
[作者]
胡廷章 秦娟 陈再刚 黄小云
为了研究番茄ＳｌＹＡＢ２Ａ基因的功能及其在番茄生长发育中的分子机理，以番茄的ｃＤＮＡ为模板，利用ＲＴＰｃＲ技术从番茄中克隆到ＳｌＹＡＢ２Ａ基因，该基因编码的蛋白质由１９２个氨基酸残基组成，蛋白质的分子量为２１．３５ｋ ＤＡ，等电点是８．７９，平均亲水系数是－０．４８７。ＳｌＹＡＢ２Ａ蛋白质的６～１６５位氨基酸残基形成ＰｆＡｍ：ＹＡＢＢＹ结构域，在２０～４７位有１个ｃ２ｃ２锌指结构域，在１２２～１８１位有１个螺旋－环－螺旋结构域。二级结构分析表明ＳｌＹＡＢ２Ａ蛋白分子中，α－螺旋占１９．７９％、β－折叠占１４．０６％、其余６６．１５％为不规则卷曲。蛋白多序列比对表明ＳｌＹＡＢ２Ａ与马铃薯、林烟草．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
李瑞 徐海霞 吴伟 王素莹 任梦可 张朋朋 徐永杰
为了研究转化生长因子β激活激酶1(Transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)在猪骨骼肌生长发育中的作用,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得猪TAK1的cDNA全长,并分析其时空表达及真核细胞中的亚细胞定位情况。结果表明,TAK1 cDNA全长2 163 bp(Gen Bank登录号:KU504629),ORF为1 740 bp,编码579个氨基酸,其氨基酸序列与人、恒河猴、绵羊的相似性均为98. 8%,表明该蛋白在不同物种间高度保守。猪TAK1蛋白具有催化丝氨酸/酪氨酸磷酸化的STKc_TAK1结构域,而在该结构域中还有多个保守的ATP结合位点、A-Loop结构域、TAB1(TGF-beta activated kinase 1)结合位点。荧光定量PCR结果显示,TAK1基因在出生后120 d大白猪的免疫器官脾脏中表达量最高,胰腺、背最长肌等组织中的表达量较低;而不同发育时期的背最长肌中,该基因在胚胎期65 d表达量最高,随着生长发育表达量下调;在不同品种间,TAK1基因在各时期大白猪中的表达量均高于梅山猪,除出生后90 d外,其他时期差异均达到显著水平或极显著水平。pcDNA3. 1(+)-EGFP-TAK1重组质粒转染C2C12细胞后的荧光共定位结果显示,TAK1蛋白的表达主要集中在细胞质中。综上,TAK1基因在猪骨骼肌发育过程中起着重要作用,为进一步研究猪TAK1基因的功能奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
贺慧 虢慧 官春云
ACP5基因是参与植物体中脂肪酸代谢的重要基因之一,在甘蓝型油菜中该基因还未被深入研究。为了弄清楚BnACP5基因在甘蓝型油菜中的螺旋结构及功能,以湘油15为试材,采用同源克隆法得到一个与脂肪酸合成相关的基因BnACP5。BnACP5基因CDs序列长417 bp,共编码138个氨基酸。生物信息分析表明,BnACP5蛋白的相对分子质量15.25 ku,理论等电点(p I)为5.94,其不稳定参数为43.03,属于不稳定蛋白;其总疏水平均系数(GRAVY)为-0.148,是一种亲水性蛋白;不含跨膜结构,也不含
[期刊] 华北农学报
[作者]
葛风伟 江一 赵惠新
水孔蛋白是位于质膜和液泡膜等生物膜上主要负责水分跨膜运输的通道蛋白。为了分析甘蓝型油菜种子萌发过程水分调控的分子机制，采用ＲＴ－ＰＣＲ法从甘蓝型油菜种子中克隆了液泡膜内在蛋白（ＴｏｎｏＰ ｌａｓＴ ｉｎＴＲｉｎｓｉＣ ＰＲｏＴｅｉｎｓ，ＴｉＰｓ）ＴｉＰ４；１基因片段序列，并对甘蓝型油菜种子ＴｉＰ４；１基因在种子萌发过程及干旱、低温和盐胁迫下的表达进行了ｑＲＴ－ＰＣＲ（ｑｕａｎＴｉＴａＴｉｖｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ）分析。结果表明，ＴｉＰ４；１基因在干种子中表达水平很低，但是在种子萌发过程中表达量增加。此外，在干旱、低温及盐的胁迫处理下，ＴｉＰ４；１基因的表达上调，结果暗示着该基因可能参与．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
肖旦望 刘聪 陈社员 官春云 熊兴华
克隆并对溶血磷脂酸酰基转移酶时空表达和逆境表达进行分析,旨在为进一步研究其生物学功能奠定基础。结合同源克隆与半定量RT-PCR的方法,克隆得到甘蓝型油菜湘油15 LPAT5的1条全长1 041 bp的CDs序列,并命名为BnLPAT5。序列分析表明,它具有LPLAT_LCLAT1样结构域,属于LPLAT超基因家族。时空表达分析表明,BnLPAT5在根中的表达量最高,是茎和胚的2倍。逆境分析表明,BnLPAT5在NaCl、PEG4000、水渍、6BA和ABA的胁迫下呈现2种不同的表达模式,他们均对BnLPAT5基因的表达具有抑制作用。在NaCl、PEG4000及水渍处理下,BnLPAT5呈"骤降...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
刘路平 刘高峰 蒋程 侯喜林
[目的]本文旨在研究不结球白菜基因BcNAC036的亚细胞定位及高温胁迫下的表达分析，并探索其功能及调控机制。[方法]以不结球白菜‘苏州青’为试验材料，提取叶片总RNA并且反转录成cDNA，同源克隆BcNAC036的全长基因序列，运用在线软件工具对其进行生物信息学分析。采用同源重组的方法构建过表达载体pCAMBIA1302-BcNAC036-GFP，农杆菌介导法将构建的过表达载体注射入本氏烟草叶片背面，通过激光共聚焦显微镜观察其亚细胞表达部位。采用RT-qPCR技术检测高温处理下不结球白菜耐高温品种‘苏州青’和热敏感品种‘矮脚黄’以及转基因拟南芥体内BcNAC036基因的表达量。对转基因拟南芥进行高温处理并统计其成活率。[结果]同源克隆的方法获得BcNAC036基因，其开放阅读框（ORF）为840 bp，编码279个氨基酸，相对分子质量为32 154.83，等电点是8.96。氨基酸序列比对以及同源进化树分析结果显示，BcNAC036蛋白与芜菁、甘蓝型油菜NAC036蛋白同源关系较近。亚细胞定位结果显示，BcNAC036的亚细胞定位表达在细胞核。RT-qPCR表明，BcNAC036在耐高温和热敏感品种中表达差异较大且表达量均呈明显下降趋势。转基因拟南芥较野生型相比，其成活率显著较低。[结论]BcNAC036蛋白在细胞核表达，BcNAC036基因与不结球白菜耐高温性呈负相关。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
肖昉 王乐 郑友峰 赖钟雄 刘生财 牟建梅
ADH基因在甜菜色素合成酪过程氨酸途径中发挥着重要作用,为探究苋菜酪氨酸途径的关键基因AtrADH2在苋菜中的功能,本研究以‘苏苋1号’‘苏苋2号’苋菜品种为试验材料,利用RT-PCR技术等研究方法克隆获得1个AtrADH2基因(GenBank登录号:MT982371)。结果表明:1)苋菜AtrADH2基因的ORF长为1 197bp,编码398个氨基酸;2)AtrADH2蛋白属于NADB_Rossmann超级家族,含有1个NADB保守结构域;3)系统进化树分析表明,AtrADH2蛋白与甜菜BvADHα蛋白亲缘关系最近;4)‘苏苋1号’中甜菜色素含量受到光周期的影响;与其它组织部位相比,叶中的甜菜色素含量最高;与幼苗期相比,开花期叶和茎的甜菜色素含量均有所下降;5)qRT-PCR分析表明,AtrADH2基因表达趋势与AtrCYP76AD1、AtrDODA和AtrMYB1基因表达趋势相反。综上,AtrADH2基因可能对苋菜甜菜色素合成具有负调控作用,为进一步研究AtrADH2基因的功能提供了参考依据。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
桂尚枝 刘雪晴 王英 唐小燕 赵龙龙 李广 吴思文 温宏伟 汪承刚 陈国户
【目的】从乌菜(Brassica campestris L.)中克隆VIN3-LIKE 2 (VIL2)基因并进行生物信息学与表达分析，为进一步研究BcVIL2基因功能奠定基础。【方法】以‘徽乌19’为试验材料，利用同源克隆等技术获得BcVIL2基因，对其序列进行蛋白分子量(MW)、糖基化位点、二级结构等生物信息学分析；利用荧光定量PCR等技术分析其应答春化表达模式。【结果】BcVIL2基因ORF (Open reading fragment)全长为1296 bp，共编码431个氨基酸，属于亲水性蛋白，预测含有1个潜在的糖基化位点和59个潜在的磷酸化位点，蛋白分子量为47.91 kDa，理论等电点(pI)为8.27；其二级结构主要由α-螺旋与无规则卷曲组成；亚细胞定位预测其可能在细胞核中发挥作用；同源序列比对分析显示该基因与芸薹属植物VIL2基因同源性较高；亲缘进化树分析也显示该基因与白菜(B. rapa， syn. B. campestris)和芥菜(B. juncea) VIL2基因亲缘关系很近；荧光定量PCR结果表明，盛花期时BcVIL2基因在根中表达量最低，在荚中表达量最高，而叶中表达量显著低于茎和花中表达量；一月苗龄植株春化后BcVIL2基因的表达量显著低于未春化时的表达量。【结论】乌菜VIL2基因响应春化负表达，与春化反应相关基因BraA01g032910.3C、BraA05g026410.3C与BraA10g016160.3C密切相关，可能存在互作关系，本研究结果为深入分析BcVIL2基因的功能提供了良好基础。
关键词：
乌菜 VIL2 春化 基因克隆 表达分析
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