【目的】从环化的中国华东葡萄白河35-1经白粉菌接种诱导后的叶片所构建的cDNA文库中,筛选抗病相关基因序列。【方法】根据植物抗病基因在氨基酸水平上的保守结构域NBS的P-loop区和LRR设计特异引物,采用三维文库筛选法,对环化的葡萄白粉菌接种诱导后的叶片cDNA文库进行PCR筛选。【结果】共建组池24个,每个组池中含有单菌落768个,包含18432个克隆。从中筛选出具有抗病基因保守序列的阳性克隆585个,其中具有NBS保守序列引物筛选出330个,LRR保守序列引物筛选出255个。对获得的阳性克隆中的插入片段进行了测序,经生物信息学分析去除重复序列后,获得422条具有抗病基因保守结构域的基因...

【目的】从中国野生华东葡萄白河35-1经白粉菌接种诱导后叶片所构建的cDNA文库中,筛选抗病相关基因。【方法】根据植物抗病基因保守序列NBS位点设计特异引物,对葡萄白粉病接种诱导后的环化cDNA文库进行菌落PCR筛选,从随机挑选的大量菌落中筛选出82个PCR阳性菌落,提取阳性菌落的质粒进一步进行PCR检测确认,对确认的36个阳性质粒插入片段进行了测序。【结果】测序结果和序列生物信息学分析结果均表明,有3个基因序列与Genbank中的已知序列有较高的同源性,其中1个基因序列与葡萄抗白粉病基因(DT661587.1)序列同源性达99%,另外2个基因序列与水分胁迫下葡萄特异表达基因(DT031657...

【目的】克隆中国野生毛葡萄"商-24"天冬氨酸蛋白酶(AP)基因的cDNA序列,明确其在葡萄抗病防御机制中的作用。【方法】在前期获得的中国野生毛葡萄株系"商-24"AP基因(VqAP)EST序列的基础上,采用RT-PCR克隆AP基因的cDNA序列,对其序列及编码产物进行生物信息学分析,并通过实时定量PCR和半定量PCR,分析VqAP基因在白粉菌诱导不同时间(0,6,12,24,48,72,96和120h),不同激素(100μmol/L水杨酸,50μmol/L乙烯和0.5g/L茉莉酸甲酯)刺激及不同组织(嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须)中的表达情况。【结果】序列分析表明,VqAP基因序列长度为1 3...

【目的】从华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’中克隆VpMYBR1基因,并进行基因表达与功能分析,为揭示抗白粉病机制提供理论依据。【方法】采用RT-PCR和RACE技术克隆VpMYBR1基因cDNA全长序列,并利用半定量和定量RT-PCR技术进行不同器官和不同处理后的表达分析;通过花序浸染法转化拟南芥,对转基因及未转化对照植株抗白粉病鉴定、台盼蓝染色和抗病标记基因表达分析研究基因功能。【结果】VpMYBR1基因cDNA序列全长539 bp,有228 bp的完整开放阅读框,编码75个氨基酸,包含1个Sant/myb结构域,GenBank登录号为HQ284197;VpMYBR1基因在‘白河-35...

为了研究番茄白粉菌与番茄相互作用的分子机制,以白粉菌诱导的番茄叶片为材料,利用SMART技术构建了番茄的AD-c DNA文库。该文库总库容量为3.77×1010cfu,重组率达到96%,插入片段长400~2 000 bp,平均长度约为1 000 bp。随机挑取50个克隆进行测序,利用生物信息学软件进行初步分析,表明获得的文库质量较高。

利用随机扩增多态性 DNA ( RAPD)技术 ,对抗病×感病的葡萄种间杂交组合白河 - 35 - 1×佳利酿的亲本及其 F1 代的 2 4株杂种进行了抗白粉病的遗传分析 ,从 196个随机引物中获得了 1个与中国野生葡萄抗白粉病基因连锁的 RAPD标记 OPV0 3- 1380 ,并在中国野生葡萄华东株系和欧洲葡萄品种中进行了分析验证。

【目的】探明葡萄白粉病侵染过程中病原与植物互作的关键时期。【方法】以抗白粉病的中国野生葡萄白河-35-1、感病欧洲葡萄品种佳丽酿及其F1代抗病株系6-12-4和感病株系6-12-2为材料,通过考马斯亮蓝G-250染色和解剖观察统计叶片的自然带菌率。采集田间白粉病发病葡萄叶片,人工接种试验叶片,于接种后0,1,3,5和7d分别采集接种叶片,制片后显微观察,研究白粉菌在葡萄叶片表面的生长和侵染过程。【结果】田间自然条件下和田间人工套袋隔离2周后,葡萄抗、感白粉病植株的新稍叶片均存在自然带菌现象,但抗病植株带菌率较低。人工压片接种后,菌丝和分生孢子成功附着在感病和抗病植株的叶片表面。随着接种后时间的...

应用cDNA-AFLP技术研究番茄根部组织应答BABA(β-Aminobutyric Acid,β-氨基丁酸)诱导后基因转录谱,得到与植物获得性抗性相关的差异表达片段29条,克隆测序后获得10个上调基因片断.经过生物信息学分析和功能预测,其同源基因都是植物体在抗病、抗逆反应中的表达序列标签.根据功能可将其分为5类:第1类是防御反应基因,为病程相关蛋白基因P69家族成员,具有蛋白水解酶功能;第2类是转运蛋白基因,负责细胞内外离子、水和小分子物质的跨膜运输;第3类是信号传导蛋白,是Ca2+信号传导途径上重要的功能蛋白;第4类是分子伴侣蛋白BIF1,协助蛋白质的复性;第5类属功能未知基因.研究表明:...

[目的]本文旨在使用“Mate＆Plate”技术构建簇毛麦受白粉菌诱导的酵母双杂交文库，鉴定正向调节小麦白粉病抗性的簇毛麦E3泛素连接酶蛋白CMPG1-V的互作蛋白，为解析其抗病性机制奠定基础。[方法]提取白粉菌诱导前及诱导后1、2、4、6、12、24和48 h的簇毛麦叶片总RNA，利用SMART技术分离纯化mRNA，合成ds cDNA，将ds cDNA和pGADT7-Rec载体共同转入酵母菌株Y187，构建簇毛麦酵母双杂交文库，明确文库插入片段大小和滴度。以CMPG1-V为诱饵筛库，并对部分互作蛋白进行了回补验证，利用BiFC方法验证CMPG1-V与筛选到的一个互作蛋白CMIN6（MYB25-V）的体内互作。[结果]成功构建了受白粉菌诱导的簇毛麦叶片酵母双杂交文库，文库滴度为9.5×10~(7 )CFU·mL~(-1)，插入片段长度在250～2 000 bp之间，重组率为100%。以CMPG1-V为诱饵筛选文库，获得79个互作蛋白，挑选其中10个互作蛋白进行回补验证。通过BiFC实验验证了CMPG1-V与MYB25-V的体内互作。MYB25-V及其在小麦中的同源基因TaMYB25受白粉菌诱导后均上调表达，推测MYB25-V可能参与调控小麦白粉病抗性。[结论]本研究成功构建了白粉菌诱导的簇毛麦酵母双杂交文库，为鉴定CMPG1-V的互作蛋白并解析其抗病性机制奠定了基础。

用化学诱抗剂BTH(benzothiadiazole)分别处理幼苗期和成株期小麦后,再接种小麦白粉病菌,以研究BTH诱发小麦对白粉病产生系统性抗性的能力。结果表明,用BTH处理幼苗期小麦后,小麦白粉病的病情指数较对照显著降低,BTH诱发小麦幼苗对白粉病产生抗性的最佳浓度为0.20~0.25mmol/L,最佳时间间隔应大于6d。对于成株期小麦,在分蘖中期和后期以0.20mmol/LBTH喷雾,对小麦白粉病的防效为60.82%,较对照增产16.00%。说明BTH可以诱导小麦对白粉病产生系统获得抗性,并可用于田间白粉病防治。

【目的】葡萄是世界性重要果树,欧洲葡萄品种因其优质高产被广泛栽培,但其突出缺点是抗病性弱,尤其易受白粉病危害。葡萄中芪合成酶(stilbene synthase,STS)的代谢产物白藜芦醇是植物体内具有抗病功能的植保素,果实中的白藜芦醇对人具有保健作用。中国野生毛葡萄‘丹凤-2’抗病性强且白藜芦醇含量高。论文旨在研究中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因(STS)及其功能,应用于抗病育种来提高欧洲葡萄抗病性及果实中芪类物质含量。【方法】同源克隆中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因VqSTS26和VqSTS32,构建pCAMBIA35S::VqSTSs::GFP过表达载体;以器官发生途径诱导的无核白分生愈伤组织作为受体材料,采用农杆菌介导法进行遗传转化,获得转基因葡萄植株;分别从转录水平和代谢产物水平比较转基因与野生型无核白在自然生长条件与人工接种葡萄白粉病菌(Uncinula necator)诱导下STS表达及芪类物质产生与积累的差异;通过显微观察白粉病菌在转基因与野生型无核白叶片上的生长发育进程,统计孢子萌发、菌丝生长与分生孢子梗形成数目,对转基因植株进行抗病性分析。【结果】通过PCR检测和Western blot鉴定,获得了稳定转化VqSTS26植株8株和稳定转化VqSTS32植株5株。在自然生长条件下实时荧光定量PCR分析表明VqSTS26、VqSTS32转基因无核白STS的表达量显著提高,芪合成酶上游基因PAL与下游基因RSGT的表达量上调,而与芪合成酶存在底物竞争关系的CHS表达下调;液相色谱分析表明芪类物质主要以糖苷的反式云杉新苷形式存在,VqSTS26、VqSTS32转基因无核白芪类物质的含量极显著高于野生型无核白。STS的表达及其产物合成受白粉病菌诱导,随白粉病菌诱导,STS表达量在1—2 dpi时显著升高,至7 dpi时表达量达最高;诱导表达产生的芪类物质由原来的反式云杉新苷新增加了反式白藜芦醇和葡萄素,且含量增加;转基因植株在STS表达量、芪类物质的积累方面均极显著高于野生型无核白。显微观察白粉病菌在葡萄叶片上的生长发育状态,对比野生型无核白,转基因植株白粉病菌生长受到抑制,菌丝发育更迟,7 dpi时转基因葡萄叶片上的分生孢子梗数量低于野生型无核白。【结论】过表达中国野生毛葡萄‘丹凤-2’VqSTS26和VqSTS32可以提高无核白中STS的表达量,促进芪类物质的形成与积累,抑制转基因无核白叶片上白粉病菌的生长。因此,中国野生毛葡萄‘丹凤-2’与其携带的STS及其产物,是定向改良欧洲葡萄品种白粉病抗性与芪类物质含量的重要种质资源与基因资源。

以大菱鲆脾脏为材料,构建cDNA文库,通过对文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,共获得3 656个大菱鲆脾脏表达序列标签(EST)。经与GenBank数据库的序列比对后发现,1 891个EST代表了149个已知基因,其余1 765个EST为未知序列。这149个基因大致可分为6类:9个为细胞结构类(6.0%);26个为代谢类(17.5%);45个为细胞防御/免疫类(30.2%);43个为基因/蛋白质表达类(28.9%);16个为细胞信号转导/细胞交流类(10.7%);10个无法明确分类(6.7%)。鉴定的与免疫抗病相关重要基因主要有:CC/CXC趋化因子;主要组织相容性复合体(MHC)cla...

以寡聚糖为诱抗剂,研究了其对黄瓜抗白粉病抗病性的诱导作用。结果显示,用寡聚糖诱抗剂在接种前处理黄瓜叶片,可以减轻黄瓜白粉病的发生,表现为菌落稀疏、变小,产孢期延迟、以及潜育期延长。寡聚糖诱抗剂最佳处理时间为接种前5~7d,持效期在10d以上。诱抗剂处理第一片真叶后可减轻上部叶片发病,上部叶片呈现较明显的抗病性反应特征。表明寡聚糖可诱导黄瓜幼苗产生对白粉病的系统获得抗病性。

为了探讨BTH对小麦白粉病抗性的诱导以及抗性的部分生理机制,分别用0.01,0.05,0.1,0.2,0.4,0.8和1.6 mmol/L苯并噻二唑(BTH)溶液处理小麦幼苗2 d后接种白粉病菌,结果表明,浓度大于0.2 mmol/L的BTH处理均能显著诱导小麦幼苗产生对白粉病的抗性;用0.4 mmol/L BTH处理小麦幼苗后间隔不同时间接种白粉病菌,表明BTH诱导小麦产生对白粉病的抗性持久期在7 d以上;对BTH处理或接种白粉病菌的幼苗几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性的测定结果表明,BTH处理可系统性地增强这2种酶的活性且与小麦对白粉病的诱导抗性密切相关。

以致病黏质沙雷氏菌人工感染的黄喉拟水龟肝组织为材料,应用SMART(switching mechanism at 5’end of RNA transcript)技术,构建了黄喉拟水龟的全长cDNA文库。首先用SMARTTM PCR cDNA systhesis kit合成全长的双链cDNA,通过琼脂糖凝胶分级分离技术切除小片段的cDNA,将大于500 bp的cDNA连接到pGEM-T载体中,电转化到J M109感受态细胞。在构建好的文库中,经测定,文库约含有1.8×105个重组子,重组效率达90%,插入片段多在0.5～3.0 kb之间。对库中长度约为1 000 bp的80个基因进行了测序,结...