【目的】目前对植物SPL8的基因功能研究主要集中在开花和育性方面,而其在干旱胁迫响应中的作用却鲜有报道。本文克隆、分析了白桦BpSPL8启动子,并研究了BpSPL8基因在拟南芥中响应干旱胁迫的功能。【方法】通过PCR克隆技术得到了白桦BpSPL8启动子;利用PLACE和PlantCARE软件对BpSPL8启动子顺式作用元件进行了预测。构建了BpSPL8启动子驱动GUS(β-葡萄糖苷酸酶编码基因)的植物表达载体,并采用浸花法将其转化至拟南芥中;继而利用GUS染色分析了BpSPL8启动子的组织表达模式;同时对BpSPL8在PEG处理下的表达水平进行了qRT-PCR分析。最后,以过表达BpSPL8拟南芥为材料来探究BpSPL8在干旱胁迫下的生物学功能。【结果】启动子元件分析显示,BpSPL8启动子中含有组织特异表达、光响应、激素响应及多个胁迫响应元件。GUS染色结果表明,BpSPL8启动子可在拟南芥的下胚轴、叶片、叶柄、根和花序中启动GUS基因表达。BpSPL8基因在PEG处理下的野生型白桦的根和叶片中均呈现先上调后下调的表达趋势。干旱胁迫下,过表达BpSPL8拟南芥的存活率和脯氨酸含量均显著低于野生型,丙二醛含量显著高于野生型;两个已知的抗逆基因DR29B和P5CS1在干旱处理后的野生型和转基因拟南芥中均上调表达;但在转基因拟南芥中呈现出延迟上调的表达模式。【结论】异源过表达白桦BpSPL8能够降低拟南芥的耐旱性,并在干旱胁迫下影响抗性基因DR29B和P5CS1的表达模式。

【目的】SPL是植物特有的转录因子，参与植物幼年期向成年期的转变、营养生长向生殖生长的转变、花发育、孢子发生、叶片和根发育、逆境响应等多个过程，在植物的生长发育过程中起着非常重要的作用。探究白桦中BpSPL6基因启动子区的顺式作用元件，以及该启动子在正常和胁迫条件下的表达模式，可为进一步研究BpSPL6基因的功能提供参考，也可为了解白桦的抗逆机制提供依据。【方法】以本实验室组培白桦的总DNA为模板，经PCR克隆了BpSPL6基因上游1 703 bp的启动子序列，用PLACE和Plant CARE在线软件分析启动子区的顺式作用元件。构建了BpSPL6基因启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体并转化拟南芥，探究其组织表达特性和胁迫条件下的表达模式。【结果】PCR成功克隆了BpSPL6基因上游1 703 bp的启动子序列，对启动子区的顺式作用元件预测发现除了含有核心启动元件TATA-box、CAAT-box外，还包括2种特异组织表达元件（根、花粉），10种激素响应元件（生长素、赤霉素、水杨酸、脱落酸），4种脱水响应元件等。对转基因拟南芥进行GUS染色结果表明，BpSPL6基因启动子驱动的GUS基因在转基因拟南芥中的表达具有时空特异性。在拟南芥的整个发育过程中，BpSPL6基因启动子驱动GUS基因在真叶叶片中表达，但是表达部位不同。随着叶片的生长，首先在叶片的顶端表达，随后扩展到叶片的叶脉并直至整个叶片，并且表达量逐渐升高。同时BpSPL6基因启动子驱动的GUS基因在拟南芥营养生长时期的根部都有表达。并且经氯化钠和甘露醇胁迫后其表达量降低。对比两种胁迫，受到氯化钠胁迫后GUS基因的表达量变化更大，说明对氯化钠胁迫的响应更加强烈。【结论】BpSPL6基因可能参与了植物的叶片、根发育以及对盐和干旱胁迫的响应。

为研究番茄ｍｉＲＮＡ在非生物逆境胁迫下的表达模式和功能分析。利用ＲｅＡｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测番茄ｍｉＲＮＡ３９７在非生物逆境（干旱、盐害、ＡＢＡ）条件下的表达量变化，发现Ｓｌｙ－ｍｉＲ３９７响应这些逆境胁迫，尤其在干旱胁迫下表达最明显。故将Ｓｌｙ－ｍｉＲ３９７过表达载体转入拟南芥中，进行转基因功能验证。结果表明：与野生型相比，转基因拟南芥植株叶片相对含水量下降速率更缓慢，保水能力更好，且在干旱胁迫下，转基因植株的长势明显优于野生型，其最大光合效率、３种抗氧化酶活性ＳＯＤ、ＰＯＤ、ＣＡｔ均明显高于野生型，同时胁迫所产生的丙二醛含量明显低于野生型拟南芥。表明Ｓｌｙ－ｍｉＲ３９７能提高拟南芥对干旱．．．

为探究大豆转录因子GRAS家族GmGRAS69基因在植物干旱胁迫中的功能和可能的分子机制。通过氨基酸序列比对和构建系统进化树分析大豆GmGRAS69与其他物种GRAS成员的序列保守性和进化关系。利用荧光定量PCR方法检测GmPP2C69基因在PEG处理的大豆根和叶中的表达模式。接着构建GmPP2C69基因过表达载体，进而利用农杆菌介导的浸花法转化野生型拟南芥；在正常培养和干旱处理条件下观察野生型和转基因拟南芥的生长表型，测定单株鲜质量、叶片相对含水量和地上部可溶性糖含量、抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性及对应的抗氧化酶基因表达水平。结果显示，GmGRAS69基因在PEG处理的大豆植株根和叶中都显著上调，并且在根中响应更显著。此外，成功获得GmGRAS69基因过表达的转基因拟南芥株系，且过表达株系的耐旱性相比野生型拟南芥WT明显增强。干旱处理后，过表达植株鲜质量、叶片相对含水量和可溶性糖含量均显著高于WT;抗氧化酶SOD、POD和CAT活性以及对应基因SOD、POD和CAT的表达水平也显著高于WT。结果表明，大豆GmGRAS69基因在干旱胁迫下表达上调，进而通过激活SOD、POD和CAT抗氧化酶编码基因、增强抗氧化酶活性和增加可溶性糖的积累，赋予转基因植株更强的耐旱性。

本文利用Ｓｉｔｅ Ｆｉｎｄｉｎｇ－ＰＣＲ方法克隆了白桦ＢＰｇｔ１４基因起始密码子Ａｔｇ上游２ １６９ ＢＰ序列，并通过ＰＬＡＣｅ启动子预测工具对其进行元件分析。结果表明，该启动子片段含有启动子核心元件及多种逆境及激素响应元件，同时具有植物苯丙烷及木质素生物合成的ＭＹＢ类转录因子的重要结合基序。研究选取了其中含有启动子核心元件的１ １５６ ＢＰ片段构建了ＰＢＰｇｔ１４∷ｇＵＳ植物表达载体，利用农杆菌侵染的方法将ＰＢＰｇｔ１４∷ｇＵＳ报告基因瞬时转化烟草植株，鉴定该启动子在烟草中的表达活性及对非生物胁迫和激素的响应模式。对转基因烟草植株进行ｇＵＳ染色，结果表明该启动子具有启动活性，且在茎段处活性较．．．

目的克隆获得番茄根特异表达启动子,为利用基因工程技术创制番茄新种质奠定基础。方法利用Clontech公司的基因组步移(genome walking)技术,扩增番茄根特异表达基因LeGRP2的上游调控序列,并构建植物表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥,以GUS为报告基因研究该调控序列的组织表达特异性。结果以番茄基因组DNA为模板,经过2次基因组步移,获得了LeGRP2基因上游1959bp的调控序列(GenBank登录号:EU262719),分析发现含有9个与根特异表达相关的顺式作用元件ROOTMOTIFTAPOX1。转基因拟南芥的组织化学染色分析表明,GUS基因主要在拟南芥的根部特异表达。结论...

以拟南芥基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到逆境胁迫诱导表达基因rd29A的启动子片段,将其克隆到pUC19质粒中进行序列分析。结果表明,获得的启动子片段大小为937bp,与已报道的该启动子序列比较,其核苷酸序列同源性为99.8%。

［目的］克隆马尾松谷胱甘肽过氧化物酶基因，并对其进行功能研究。［方法］采用ＲＡＣＥ技术克隆基因Ｃ ＤＮＡ序列，实时荧光定量ＰＣＲ检测基因在马尾松干旱胁迫下的表达模式，花序浸泡法转化拟南芥，并对转基因与野生型拟南芥的生长表型和根系生长进行分析。利用荧光显微镜技术对转基因拟南芥不定根进行ＧＦＰ荧光检测。［结果］克隆到１个８７１ ｂＰ的ＧＰＸ基因全长Ｃ ＤＮＡ序列，命名为Ｐｍ ＧＰＸ６。Ｐｍ ＧＰＸ６包括５１３ ｂＰ的完整开放阅读框，编码１７０个氨基酸残基。Ｐｍ ＧＰＸ６蛋白与油松Ｐｔ ＧＰＸ蛋白同源性达９５％。Ｐｍ ＧＰＸ６在马尾松根中高表达，茎、叶中表达量低。在干旱胁迫下，Ｐｍ ＧＰＸ６在根、茎．．．

将低温诱导启动子AtRD29 a控制的GUS基因转入烟草,通过GUS活性组织染色,分析拟南芥AtRD29 a启动子在烟草植株中的表达特性;结果表明:外源基因已经整合到烟草基因组中,并且AtRD29 a启动子在烟草中同在拟南芥中一样,不具有组织表达特异性,而是低温诱导型启动子;它在25℃常温下不表达,10℃左右为诱导临界温度,4℃左右稳定和高效表达。

从烟草中克隆到1个受甲基茉莉酸和水杨酸双重诱导的糖基转移酶基因GT-MS,将其翻译起始位点5′上游-800~+1启动子序列取代pCAMBIA1301质粒的35S启动子,构建GT-MS启动子与Gus基因融合的植物表达载体,采用花序浸染法转化拟南芥,得到阳性植株。对转基因植株进行组织化学染色,结果表明,GT-MS启动子在拟南芥不同生长发育时期及不同器官均有表达,但主要是在维管组织表达,且韧皮部的表达高于木质部。MeJA和SA诱导后GUS活性增强,Gus基因RNA表达量成倍增加。表明GT-MS启动子与在烟草中相似,在拟南芥中也受MeJA和SA诱导。

【目的】IrrE是从耐辐射异常球菌中发现的全局调控蛋白,主要通过修复强辐射等逆境条件下DNA损伤,提高耐辐射异常球菌对极端逆境环境的抗性。研究按植物密码子优化的irrE后导入烟草对转基因烟草耐逆能力的提高,为棉花等作物耐逆育种研究打下基础。【方法】按照植物密码子优化细菌irrE并合成基因;通过酶切连接法构建irrE植物表达载体;通过叶盘法转化烟草并PCR验证获得阳性转基因再生苗;通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析转基因株系中irrE的表达量;通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测I

【目的】盐胁迫是影响植物生长发育的不利环境因子。蛋白激酶PKS5作为植物盐超敏感信号转导途径的重要组分，在植物响应盐胁迫过程中具有重要调节功能。本文旨在生理水平和分子水平上，探究胡杨PePKS5基因在植物耐受盐胁迫过程中的调节作用。【方法】克隆胡杨PePKS5基因，并在拟南芥中过表达，获得T_3代转基因拟南芥纯合体。观察盐胁迫下转基因拟南芥株系的耐盐表型，测定其过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶活性及盐胁迫响应基因的表达量。利用非损伤微测技术测定转基因拟南芥株系根尖Na~+、K~+动态离子流，利用激光共聚焦显微镜观测转基因拟南芥株系根尖Na~+和H_2O_2含量。测定盐处理后转基因拟南芥土培幼苗的叶绿素荧光参数、光合参数等生理指标，揭示PePKS5基因在盐胁迫下对拟南芥的生理调节作用。构建亚细胞定位载体，通过瞬时转化烟草，对PePKS5蛋白进行亚细胞定位观测。【结果】（1）PePKS5基因的CDS序列编码417个氨基酸，PePKS5氨基酸序列与毛白杨PtPKS5相似度最高，并且亲缘关系最近。（2）PePKS5定位于细胞质和细胞核中。（3）NaCl处理6 h后，胡杨叶片PePKS5基因表达量上调，72 h后逐渐恢复至正常水平。（4）盐胁迫下过表达PePKS5基因的拟南芥株系（PePKS5-OE10和PePKS5-OE15）的生存率和根长均明显高于野生型（WT）和转空载体（VC）株系。（5）与WT和VC株系相比，PePKS5-OE10和PePKS5-OE15株系的POD和CAT活性增强，APX1和CAT2基因的表达量均升高。（6）盐胁迫下PePKS5-OE10和PePKS5-OE15株系的Na~+外排和K~+的内流明显高于WT和VC株系，并且在根尖中积累的Na~+浓度和H_2O_2浓度明显低于WT和VC株系。（7）盐胁迫下PePKS5-OE10和PePKS5-OE15株系的叶绿素相对含量、PSⅡ最大光量子效率、实际光合量子产量和相对电子传递速率均高于WT和VC株系。（8）盐胁迫下PePKS5-OE10和PePKS5-OE15的净光合速率高于WT和VC株系，而胞间CO_2浓度、气孔导度和蒸腾速率均低于WT和VC株系。【结论】过表达胡杨PePKS5基因能够增强拟南芥对Na~+的外排能力，维持植物活性氧的平衡状态，以及保持相对稳定的光合作用能力，从而提高拟南芥的耐盐能力。

报道了从模式植物拟南芥花ｃ Ｄ Ｎ Ａ 文库中分离鉴定的一个克隆。该ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的长度为 ８８７ ｂｐ，其编译的蛋白质推断为２６８ ａａ（氨基酸），与大豆营养贮藏蛋白（ Ｖ Ｓ Ｐ）的同源率达 ５０％ 。 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析表明，该基因在拟南芥叶片中仅有微量表达，但在花蕾、幼荚及茎中表达量丰富。采用发育后期的花为材料进行原位杂交，发现该基因的表达仅限制于子房壁。

为进一步研究转录因子TCP4在植物生长发育过程中的调控作用和下游靶基因。利用生物信息学分析转录因子TCP4家族及其蛋白序列,扩增AtTCP4基因CDS序列、构建原核表达载体并诱导纯化获得蛋白,利用凝胶电泳迁移试验(EMSA)验证AtTCP4蛋白与拟南芥功能基因LOX2启动子区域的顺式作用元件结合。生物信息学分析表明,拟南芥TCP蛋白含有非典型的螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域;系统进化树表明,AtTCP4属于Ⅱ类TCP蛋白;蛋白三级结构预测表明:转录因子TCP4可以形成同源或异源二聚体。特异性引物扩增获得AtTCP4基因的CDS序列,其开放阅读框(ORF)长为1 263 bp。构建原核表达载体pET-28a-AtTCP4并转化到Rosetta(DE3)感受态中,经IPTG诱导、纯化和Western Blot检测证明获得AtTCP4蛋白。EMSA试验验证AtTCP4蛋白能够结合到功能基因LOX2的顺式作用元件。转录因子TCP4结合功能基因LOX2启动子区域,影响植物激素茉莉酸的生物合成,调控植物的生长发育过程。

为研究水稻中PLT基因的表达及功能,利用同源序列分析,在水稻基因数据库中检索到2个与拟南芥PLT基因高度同源的基因序列,命名为OsPLT7和OsPLT11。根据进一步预测的PLT启动子序列设计引物,以水稻品种中花11的基因组DNA为模板,用PCR方法扩增得到PLT7、PLT11的启动子片段,克隆至含有报告基因的表达载体上并转化水稻。通过GUS染色观察T1代转基因阳性植株,发现OsPLT7和OsPLT11在水稻根部干细胞小生境和中柱部位表达,表达模式类似于其同源基因在拟南芥中的表达谱。