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[期刊] 水产学报
[作者]
李方 叶巧真 何建国 王莉真
A pair of primers was designed based on the vp28 gene and PCR was performed to amplify the gene from WSSV DNA. Inserting the DNA fragment to the yeast-E.coli shuffle vector pPICZ and the recombinant plasmid (pPICZVP28) that contains the target DNA fragment was obtained in the E.coli strain.The pPICZ...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
耿小雪 王小霞 周怡 徐玮 张文兵 麦康森
近年来，重组ＶＰ２８和ＶＰ２６蛋白作为蛋白亚单位疫苗，在增强对虾抗白斑综合征病毒（ＷＳＳＶ）感染的过程中具有重要作用。本研究根据Ｇｅｎ Ｂａｎｋ中ＷＳＳＶ的基因序列设计引物，以ＷＳＳＶ粗提液为模板进行普通ＰＣＲ扩增，得到ＶＰ２８和ＶＰ２６基因，再用引物悬挂法将ｅＣｏ ＲⅠ和ＸＢａⅠ酶切位点分别添加到ＶＰ２８和ＶＰ２６基因的５端和３端。目的基因经双酶切后插入到表达载体Ｐ ＧａＰＺαａ，转化ＴｏＰ１０大肠杆菌，经博莱霉素（ＺｅｏＣｉｎ）抗性筛选阳性重组酵母表达载体。ａＶＲⅡ酶切线性化之后，电击转化Ｘ－３３毕赤酵母感受态细胞，经ＺｅｏＣｉｎ抗性筛选得到阳性重组酵母。ＳＤＳ－ＰａＧｅ电泳分析重组酵母表．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
贾睿 朱婵 庄旻敏 廖圣瑜 施定基 何培民
自二十世纪90年代,白斑综合征病毒(WSSV)就因其暴发范围广、致死率高得到了广泛的关注。研究主要集中在确定该病毒蛋白的结构及功能,以及利用其囊膜蛋白制备亚单位疫苗、研发DNA疫苗等来提高对虾抵抗白斑综合征病毒的能力,尽管免疫防治目前在实验室阶段已取得了显著的保护效果,但因其给药方式局限以及成本较高等因素一直没有应用于实际生产中。VP19和VP28是白斑综合征病毒主要的囊膜蛋白,在WSSV感染对虾的过程中起着非常重要的作用。本文从WSSV的基因组学、VP19和VP28的蛋白质结构及其在免疫防治中的应用等方面概述了VP19和VP28的研究进展,包括蛋白亚单位疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗以及相关抗体的研究。在总结了不同类型疫苗的保护效果后发现,VP19和VP28的双价疫苗的保护率较高,为今后制定有效的WSSV控制方法提供了参考。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
王晓兰 贡成良 薛宇醒 曹广力 魏育红 陈辉 许雅香 张伟明 薛仁宇
根据已公布的罗氏沼虾白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28基因序列设计一对特异性引物,从疑似患白斑病毒病的罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)中提取总DNA,并以此为模板,经PCR扩增、克隆并测序后将该片段通过GenBank比对,证实为WSSV的VP28基因;与20个已公布的WSSV VP28进行同源性比较,结果显示:从中国对虾、斑节对虾、南美白对虾、日本对虾、波纹龙虾提取的病毒株聚为一类,印度对虾WSSV VP28为另一类,罗氏沼虾WSSV VP28又单独为一类。根据测序结果推测VP28蛋白的二级结构在氨基酸的7～29区间可能为跨膜螺旋区,且该区域高度保守。
[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
王永杰 潘庭双 李艳和 佘磊
白斑综合征病毒(WSSV)是一种已给世界养虾业造成了严重危害的病原体。根据GenBank上公布的WSSV囊膜蛋白基因VP31的序列,设计并合成特异引物,PCR扩增得到VP31基因,大小为783 bp。通过引物两端的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点连接该基因,然后将其构建到家蚕杆状病毒表达载体pFASTBAC HTB上。重组的家蚕杆状病毒转染5龄家蚕幼体内表达,表达产物经SDS-PAGE检测,显示与预期31 kD大小相吻合的蛋白带。用Ni2+柱纯化该蛋白免疫新西兰大白兔制备抗体,肌肉注射克氏鳌虾进行活体中和病毒试验。中和试验结果显示,囊膜蛋白VP31与白斑综合征病毒的侵染性相关,对病毒的侵染性可能...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
赵建梅 唐小千 战文斌
为了鉴定对虾白斑病综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP110在中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃细胞中的结合蛋白,运用pET-32(a)+载体构建了1段含RGD模体的截短VP110原核重组表达质粒,转化大肠杆菌诱导表达后获得分子量为41 kD的截短重组VP110蛋白(rVP110)。以rVP110作为诱饵蛋白,运用pull-down实验结合蛋白质谱分析鉴定rVP110结合蛋白,结果显示,中国明对虾鳃细胞中的肌动蛋白和精氨酸激酶(arginine kinase,AK)与rVP110具有结合作用。利用PCR扩增中国明对虾AK编码基因,将其与表达载体pGEX-4T-1连接...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
李新新 刘庆慧 张秀丽 黄倢
以pYD1为载体,制备以酒精酵母为载体的基因工程免疫制剂。参照GenBank中对虾白斑综合征病毒VP28基因序列设计引物,PCR扩增得到预期长度的产物,双酶切插入用于酒精酵母表面展示的穿梭质粒载体pYD1,转化大肠杆菌TOP10,提取阳性质粒转化酒精酵母菌株EBY100,诱导表达后,用免疫荧光检测外源蛋白的表达。结果获得VP28酵母表面展示菌,测得最佳诱导时间为36～48h。以此展示酵母活细胞分设两个浓度组,腹腔注射螯虾,检测其毒性。结果表明,此重组酵母对螯虾是安全的,该研究为下一步对虾用活载体免疫制剂效果的研究奠定了基础。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
姜有声 战文斌 程顺峰 王世表
为了更好地研究对虾白斑综合征病毒(WSSV)蛋白VP19在WSSV感染过程中的作用,利用VP19的单克隆抗体直接对VP19进行了定位。从患白斑综合征的中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃丝中提取WSSV,将提纯的WSSV经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,然后洗脱提纯其病毒蛋白VP19并免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合,用间接免疫荧光技术(IFAT)和Western-Blot技术筛选出1株阳性杂交瘤细胞,将检测出的阳性杂交瘤细胞经有限稀释法克隆,研制出抗VP19的单抗,再利用免疫胶体金技术对病毒蛋白VP19进行定位,结...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
陈文博 谭珍一 刘庆慧 侯林 黄倢
根据GenBank上WSSV囊膜蛋白基因vp28的序列,设计合成引物,PCR扩增得到vp28基因,成功构建重组表达载体pBAD/gⅡIA-VP28并转化大肠杆菌E.coli。用L-阿拉伯糖在37℃诱导重组基因工程菌,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,显示有与预期大小31kDa相符合的目的蛋白。荧光显微镜方法分析显示,表达的VP28可与克氏原螯虾血细胞结合。结果表明,在合适的培养条件下,构建的重组表达载体pBAD/gⅡIA-VP28不仅能够表达vp28基因,而且表达的VP28具有很高的抗原结合活性。
关键词：
白斑综合症病毒 vp28 表达 活性分析
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
张正阳 张春莉 施定基 贾晓会 贾睿 何培民
VP28是对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的囊膜蛋白。将VP28基因序列密码子优化后合成,经限制性内切酶NdeⅠ、XhoⅠ酶切后,按正确的阅读框顺序插入到p ET-28a(+)表达载体上。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经质粒双酶切、测序鉴定后成功地构建了VP28基因原核表达载体p ET-28a-VP28。转化菌经IPTG诱导,SDS-PAGE显示含有与预期大小一致的约30 ku蛋白带,主要以包涵体形式表达。采用Ni-IDA-Sepharose C
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
张平 李晨 黄倢 梁艳 刘庆慧 刘莉
将VP110基因的部分序列克隆到pET-28a载体中构建pET28a-vp110b重组质粒并进行原核表达,获得重组表达的蛋白rVP110-B;用rVP110-B注射凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei后,经WSSV感染,实验表明,该蛋白注射使凡纳滨对虾感染WSSV的半数死亡时间比对照组延长了20%。用表达纯化的该重组蛋白制备了兔抗rVP110-B多克隆抗体,该抗体用于凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白与rVP110-B的Far-western分析显示,凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白中除90 kDa左右的血蓝蛋白外,在41.7 kDa存在结合条带,经质谱分析表明这条鳃细胞膜蛋白是肌动蛋白。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
王树云 李江宇 高志强 谷强 蒲静 任彤 张伟 张旻 江育林 武勇 张利峰
根据Gen Bank中鲤春病毒血症病毒(SVCV)糖蛋白全基因序列设计特异性引物,以SVCV欧洲株病毒核酸为模板,通过RT-PCR方法获得欧洲株SVCV-G基因,克隆至p PICZαA,构建p PICZαASVCV1540表达质粒。以限制性内切酶Sac I线性化p PICZαASVCV1540后通过化学法转化毕赤酵母感受态细胞X33和GS115,添加1%甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物显示其分子质量为70 ku。Western Blot分析显示该蛋白可以被SVCV山羊多抗识别,表明目的蛋白具有反应原性。
关键词：
鲤春病毒血症病毒 糖蛋白 毕赤酵母
[期刊] 淡水渔业
[作者]
苏岚 曾令兵 周勇 张辉 高正勇 张金凤
根据GeneBank中草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)104株VP6蛋白的全基因序列(HM234682)设计一对特异引物,以提取的GCRV-104核酸为模板,采用RT-PCR技术扩增VP6蛋白编码基因,并将其克隆到含强启动子AOXⅠ的毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZB上。重组酵母质粒pPICZB-VP6经SacⅠ线性化,电击转化到毕赤酵母KM71菌株中,Zeocin抗性平板上筛选高拷贝转化子。阳性转化子在30℃,0.5%(V/V)的甲醇添加量的条件下,连续诱导3 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-Blotting检测,...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
吴成龙 史成银 黄倢 孔晓瑜
依据大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot viral reddish body iridovirus,TRBIV)主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)基因序列,设计了一对特异性引物,并在正反向引物中分别引入EcoR I和Not I酶切位点,从而将PCR扩增得到的TRBIV MCP基因双酶切后定向克隆到真核表达载体pGAPZαA的GAP启动子的下游位点,并电转化入大肠杆菌DH5α宿主菌内。经抗生素Zeocin筛选、PCR、EcoR I和Not I双酶切以及测序分析,构建了含有α-factor信号肽的真核重组表达载体pGAPZαA MCP。重组表达质粒pGAPZαA MC...
[期刊] 水产学报
[作者]
黄锋涛 熊海林 曹胜波 熊传喜 王敏 王卫民 吴兵 刘玉林 刘学芹
为构建基于杆状病毒表达系统的CCV新型亚单位疫苗,将CCV的囊膜蛋白基因ORF6克隆至杆状病毒转座载体pFastBacTM 1质粒中,并将阳性重组转座质粒转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得重组子rBacmid-ORF6。在脂质体介导下将该重组子转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒AC-ORF6。AC-ORF6感染的sf9昆虫细胞,经超薄切片电镜观察,可见重组杆状病毒呈多粒包埋,经间接免疫荧光、Western-blotting检测,CCV的ORF6蛋白可以在感染了AC-ORF6的sf9细胞中表达。研究表明,获得了插入ORF6基因的重组杆状病毒,并且该基因可以在重组杆状...
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