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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
潘群兴 何孔旺 温立斌 郭容利 黄克和
应用基因重组技术,构建猪圆环病毒2型ORF2基因与白介素2基因(IL-2)的真核双表达载体并将其转染CHO细胞,通过RT-PCR、间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光检测(IFA)等方法验证基因的表达情况。结果表明:成功构建了猪圆环病毒2型ORF2基因和IL-2基因的真核双表达质粒pIRES-ORF2-IL-2,该质粒可在体外同时表达ORF2和IL-2。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
琚春梅 陈焕春 郗鑫 刘正飞 曹胜波
目的以伪狂犬病病毒为载体,构建表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组病毒,并研究其生物学特性。方法将猪2型圆环病毒ORF2基因插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体中,构建猪2型圆环病毒-伪狂犬病病毒重组中间转移质粒,然后将该质粒与伪狂犬病病毒TK-/gG-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行重组病毒的筛选及生物学特性测定。结果利用检测PCV2ORF2基因和LacZ基因的PCR方法筛选到重组病毒TK-/gG-/ORF2+,同时用Southernblotting证实外源基因PCV2ORF2已成功插入到TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组中。间接免疫荧光试验(...
[期刊] 华北农学报
[作者]
张秀珊 曹洪战 张丽青 刘涛 陈赛娟 孙继国
以PCV2 PK-15细胞毒提取的DNA为模板,用PCR扩增PCV2ORF2基因的后部约600 bp片段;对PCR产物回收纯化后与载体pMD19-T进行连接、转化,经酶切和序列分析后亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-32a-ORF2,转入大肠埃希氏菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳和Western-Blotting分析。结果表明,重组表达质粒在大肠中所表达的融合蛋白相对分子量为40 kDa,Western-blotting分析表明该蛋白具有PCV2抗原性。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
陈美玲 陈焕春 宋云峰 黄红亮
参照Genbank上公开发表的PCV1 全基因序列设计引物,以质粒pSK PCV为模板扩增出PCV1 ORF2基因,插入pMD18 T载体,对筛选出的阳性质粒进行测序,将测序结果同Genbank上发表的PCV1 基因序列相比较,同源性达97%,再与Genbank 上发表的PCV2 的ORF2 基因序列相比较发现PCV1 ORF2 和PCV2 ORF2的差异表现在两者在核苷酸序列的2个部位互相存在基因缺失现象。将推导出的PCV1 ORF2 的氨基酸序列同PCV2 ORF2进行比较,发现二者在几个功能区相当保守,尤其是N 末端的核定位序列、N 糖基化位点以及酪氨酸磷酸化位点。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
彭树英 安志兴 张涌
为深入研究bcl 2对细胞凋亡的调控机制和肿瘤发生发展的影响,应用基因重组手段,根据表达载体pEGFP C1上的多克隆位点和bcl 2基因序列设计了1对引物,对含有bcl 2基因的质粒pWB bcl进行了PCR扩增,得到了708bp的目的片断。将其克隆到pMD18 Tvector,筛选阳性克隆并测序,序列分析表明,其与原初序列同源性达99%。将bcl 2插入到载体启动子下游,与报告基因绿色荧光蛋白(EnhancerGreenFluorescentProtein,EGFP)融合,经限制性内切酶酶切和PCR鉴定,证明Bcl 2/EGFP真核表达质粒构建成功。
关键词：
bcl2 绿色荧光蛋白 真核表达质粒
[期刊] 华北农学报
[作者]
王小敏 何孔旺 张文文 王东田 周忠涛 张雪寒 周俊明 汪伟 倪艳秀 温立斌
为了克隆猪输血传播病毒2型(TTV2)ORF1基因,构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达猪TTV2 ORF1蛋白,并对其表达条件进行优化。利用普通PCR从猪TTV2阳性样本中扩增出TTV2 ORF1基因,利用分子克隆的方法将猪TTV2 ORF1基因克隆到原核表达载体pcoldI上,构建表达载体pcold-ORF1,在大肠杆菌中诱导表达带有6个组氨酸标签的ORF1融合蛋白。并对影响重组蛋白表达的3个因素,即诱导时间、诱导温度和IPTG浓度进行优化,确定了pcold-ORF1重组蛋白表达的最佳表达条件。SDS-PAGE分析结果表明,重组蛋白在BL21中高效表达,以包涵体形式表达...
关键词：
猪输血传播病毒2型 基因克隆 原核表达
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
蒋静 孙建和 陆苹
应用Long and Accurate—PCR(LA-PCR)技术,扩增克隆了鸡传染性法氏囊病病毒上海超强毒(wIB-DV)的VP2—4—3基因。应用粘性末端连接策略,将VP2-4-3基因克隆人真核表达载体pALTER-MAX。经酶切鉴定,表明VP2-4-3基因为正向插入,位于CMV启动子下游。该真核表达质粒在脂质体的介导下转染Vero细胞,经特异性抗IBDV抗体的免疫荧光检测,发现在细胞内有特异蛋白表达。
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
张立娜 刘培欣 曹殿军 闫丽辉 贾竞波 危艳武
以含有全长猪γ干扰素基因的质粒为模板,通过PCR方法扩增猪γ干扰素并引入酶切位点,酶切后与PCI真核表达载体连接在一起,测序后经比较,所扩增序列同Genebank报道的IFN-γ序列同源性为99·8%.将重组质粒转染PK细胞,检测所转染的pIFN-γ的抗病毒活性.试验结果表明,转染pIFN-γ试验组与正常细胞接毒对照组比较有显著差异,说明所构建的重组质粒转染后具有抗病毒作用.
关键词：
猪γ干扰素 真核表达 活性测定
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵晓云 乔绪稳 陈瑾 李鹏成 于晓明 朱国强 郑其升 侯继波
【目的】研究利用大肠杆菌可溶性表达ＰＣＶ２ｂ亚型ＯＲＦ２基因，利用重组ＣａＰ蛋白制备ＰＣＶ２ ＶＬＰ疫苗的可行性。【方法】根据大肠杆菌密码子使用频率表优化合成ＰＣＶ２ ＮＪ株ＯＲＦ２基因，将其插入原核表达载体Ｐ ＱＺ１，鉴定阳性后转入表达宿主菌ｂＬ２１，利用原核表达平台ＣＶＣ１１０２对重组菌进行诱导表达。利用ＳＤＳ－ＰａＧＥ与ＷＥＳｔＥＲＮ ｂＬＯｔｔｉＮＧ对目的基因的表达及产物的可溶性进行分析；利用电镜分析技术鉴定重组ＣａＰ蛋白ＶＬＰ组装；利用ｂＣａ试剂盒测定重组大肠杆菌破碎后上清中总蛋白量，利用薄层扫描分析确定目的蛋白百分比，得出目的蛋白量，将重组ＣａＰ蛋白的浓度调整为１ ｍＧ·ｍ Ｌ－１．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵晓云 乔绪稳 陈瑾 李鹏成 于晓明 朱国强 郑其升 侯继波
【目的】研究利用大肠杆菌可溶性表达PCV2b亚型ORF2基因,利用重组Cap蛋白制备PCV2 VLP疫苗的可行性。【方法】根据大肠杆菌密码子使用频率表优化合成PCV2 NJ株ORF2基因,将其插入原核表达载体pQZ1,鉴定阳性后转入表达宿主菌BL21,利用原核表达平台CVC1102对重组菌进行诱导表达。利用SDS-PAGE与Western blotting对目的基因的表达及产物的可溶性进行分析;利用电镜分析技术鉴定重组Cap蛋白VLP组装;利用BCA试剂盒测定重组大肠杆菌破碎后上清中总蛋白量,利用薄层扫描分析确定目的蛋白百分比,得出目的蛋白量,将重组Cap蛋白的浓度调整为1 mg.mL-1。使...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
邓明俊 张彦明 梁荣 段明星
为进一步研究基因疫苗的免疫机制和基因疫苗的免疫效果 ,应用 DNA重组技术 ,根据载体 pc D-NA4 .0 / His Max的多克隆位点设计引物 ,对含有 NDV保护性抗原基因 F的质粒 PCR扩增。将得到的目的片段插入到载体的启动子下游 ,成功得到含有 NDV F基因的真核表达质粒载体 PC4 F的基因疫苗。
关键词：
鸡新城疫病毒 F基因 基因疫苗
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
汤智慧 郭抗抗 张彦明 王津津 李宇立 向华
【目的】分离得到猪圆环病毒2型(PCV-2)陕西杨凌株,测定病毒滴度(TCID50),并进行全基因组序列比对,为研制针对性更强的PCV-2疫苗提供理论依据。【方法】从经PCR检测为猪圆环病毒2型阳性的病料中,分离病毒并接种PK-15细胞,通过PCR检测、间接免疫荧光试验及电镜观察,对分离病毒进行鉴定;用免疫过氧化物酶细胞单层试验(IPMA),测定分离毒株的TCID50,并对其全基因组序列进行测定与分析。【结果】分离得到1株猪圆环病毒2型毒株,分离株在PK-15细胞上的TCID50为10-4.75。全基因组序列同源性比对发现,分离株与一加拿大分离株(DQ200735)同源性最高(99.4%)。【...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
张梦珂 杜柏槐 陈绍红 刘铀
【目的】本文研究了广东猪圆环病毒2型(PCV2)基因的遗传变异。【方法】采集来自不同猪场疑似PMWS的组织样品15份,用PK-15细胞增殖病毒,并进行间接免疫荧光试验鉴定,采用PCR方法扩增PCV2全基因组序列,分析其核苷酸和氨基酸序列的变异情况。【结果】GD-1和GD-2属于PCV2d亚型,其基因组由1767个核苷酸组成;GD-3,GD-4和GD-5属于PCV2a亚型,基因组由1768个核苷酸组成。5个分离株的核苷酸序列同源性为95.0%~99.9%;PCV2分离株ORF1的核苷酸和氨基酸序列高度保守,其同源性分别为96.8%~100%和99.4%~100%;GD-1和GD-2由702个核苷酸组成,编码233个氨基酸,GD-3、GD-4和GD-5由705个核苷酸组成编码234个氨基酸,5个分离株ORF2的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.9%~99.9%和88.0%~100%。【结论】广东省确实存在PCV2,但可能存在由PCV2b到PCV2d的变异。因此,有必要进一步研究PCV2基因变异对其致病性与Cap蛋白抗原性的影响,为培育和筛选更为有效的疫苗株奠定基础。
关键词：
猪圆环病毒2型 全基因组 序列分析
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
涂亦娴 张馨玉 金华利 杨福 刘明羽 张富春 王宾
比较猪瘟病毒E2基因的真核表达质粒proVAX-E2n和pVP22-E2n体外表达效率以及体内的免疫效果,以从中选出高效的猪瘟病毒核酸疫苗。将上述表达载体转染Hela细胞进行体外表达后,用RT-PCR和间接ELISA法检测Hela细胞体内和体外表达产物;免疫6~8周龄昆明白小鼠,用间接ELISA法和MTS法检测小鼠血清中CSFV特异性IgG抗体水平以及脾脏中淋巴细胞增殖功能。结果表明2种E2重组质粒均能在Hela细胞中正确表达,且proVAX-E2n的E2蛋白表达量(OD值为0.575 4)明显高于pVP22-E2n(OD值为0.306 05)(P<0.05);proVAX-E2n刺激机体产生...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
卢权威 郭官鹏 崔保安 陈红英 魏战勇 郭敬 吴宇阳 李坤 钞安军
【目的】对河南部分地区疑似猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染猪进行病毒分离鉴定,并对分离株的全基因组序列进行分析。【方法】对郑州、焦作两地疑似PCV2感染的猪淋巴结、脾脏和肺脏组织进行PCR检测,对检测为阳性的病料进行PCV2的分离,利用间接免疫荧光试验和PCR扩增进行初步鉴定。用PCR扩增PCV2全基因,经克隆、测序后,用MEGA5.1软件对克隆的序列与GenBank上获取的其他PCV2全基因组进行序列比对。【结果】分离到2株病毒,分别命名为ZHENGZ-12株和JIAOZ-12株。间接免疫荧光试验结果显示,感染病毒的细胞出现了特异的亮绿色荧光...
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