将白三叶Trifolium repens L.无菌种子吸胀15 h后,制备子叶分别放在含不同浓度配比激素的培养基上培养,同时测定白三叶子叶对卡那霉素(Kam)、头孢霉素(Cef)和羧苄青霉素(Carb)的敏感性,探索出适合子叶生长成苗的一套比较完整的体系。结果表明,用于白三叶子叶遗传转化的培养基为MS+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L6-BA+20 mg/L Kam+250 mg/L Carb。抗性植株最佳生根培养基为MS+15 g/L蔗糖+8 g/L琼脂+0.2 mg/L NAA。通过本实验成功确立了白三叶遗传转化体系,为下一步转基因实验奠定了基础...

采用根癌农杆菌介导的国槐叶盘转化法,在建立修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)转化体系过程中,对影响农杆菌转化频率的各种因素进行研究。结果表明:国槐叶片需在黑暗条件下在MS培养基上预培养5天,农杆菌菌株选用GV3101,农杆菌共培养3天较合适;农杆菌菌液浓度OD600约为0.7,感染时间10min;侵染前的菌液和共培养基中添加200μmol·L-1乙酰丁香酮(AS)对国槐遗传转化有明显的促进作用;抑制农杆菌生长的抗生素浓度以头孢霉素(Cef)500mg·L-1最好。PCR和Southern blotting检测证实sck基因已整合到国槐基因组中。

为了提高农杆菌介导的黄瓜遗传转化效率,以亚洲生态型长春密刺、欧洲生态型Poinset76和Marketmore763种黄瓜为材料,筛选了适合遗传转化最佳的基因型,并通过改变培养基固化剂、添加抗氧化剂和有机添加物的方式对遗传转化体系进行优化。结果发现,3种基因型黄瓜中,长春密刺的抗性芽诱导分化表现最佳,而Poinset76和Marketmore76稍差;在脱乙酰吉兰糖胶为固化剂的培养基上,3种基因型的抗性芽诱导率比以琼脂粉为固化剂的培养基诱导率分别高28.21,19.71,15.39个百分点;共培养基中添加50 mg/L抗氧化剂α-硫辛酸时,长春密刺抗性芽诱导率最高达66.67%,平均芽分化数最...

为了优化84 K杨的再生和遗传转化体系,以84 K杨树叶片为外植体,采用正交试验研究了不同培养基和激素配比对芽和芽苗生根的影响,并从预培养时间、浸染菌液浓度、浸染时间、共培养时间及添加AS(乙酰丁香酮)5个方面,以卡那霉素抗性苗频率为衡量指标,研究了各因素对84 K杨遗传转化率的影响。结果表明,84 K杨叶片最适的芽诱导培养基及激素配比为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L,芽苗最适诱导生根培养基及激素配比为1/2 MS+NAA 0.05 mg/L+IBA 0.05 mg/L;优化筛选的最适转化体系为:农杆菌活化菌液用MS液体培养基稀释10倍,浸染5 min,共培养4 ...

以甘蓝型油菜（ＢｒａｓｉｃａｎａｐｕｓＬ．）９５０６品系的下胚轴为受体，用根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）介导，进行了除草剂Ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ抗性基因（ｐａｔ）的转化试验，得到了抗卡那霉素（Ｋａｎ）选择剂的小植株，并对影响转化的一些因素进行了研究。试验结果表明：Ｋａｎ和羧苄青霉素（Ｃｂ）对芽再生均具有很强的抑制作用；用含２，４－Ｄ的培养基对下胚轴进行预培养和选择培养基中附加ＡｇＮＯ３均能促进转化细胞的生长和芽的再生。转化植株对Ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ除草剂的抗性和分子验证工作正在进行中。

【目的】建立PEG介导的高效银耳(Tremella fuciformis)芽孢遗传转化体系。【方法】采用PEG介导的原生质体法把表达质粒pAN7-1(含有构巢曲霉gpd-An启动子和潮霉素抗性基因hph)和pLg-hph(含香菇gpd-Le启动子和hph基因)转化进银耳芽孢的细胞中;采用夹层法在含50μg·ml-1潮霉素的筛选培养基中初筛银耳芽孢假定转化子,之后转接于潮霉素含量为100μg·ml-1的PDA平板上进行第2次筛选。【结果】PEG4000浓度为25%时介导的银耳芽孢原生质体初转化率最高;pLg-hph假定转化子经过PCR鉴定及Southern杂交验证,结果表明hph基因能有效整合进...

【目的】以楸树胚性愈伤组织为受体,建立有效的楸树遗传转化体系,为今后楸树性状的遗传改良奠定基础。【方法】通过农杆菌EHA105介导以胚性愈伤组织作为外植体进行遗传转化,通过正交试验获得最优的遗传转化条件,进而将外源基因转入到楸树基因组中。【结果】在1/2 MS培养基中添加不同梯度浓度的卡那霉素(Kana)进行选择压力筛选,在添加了60 mg·L~(-1)Kana的1/2 MS培养基中,楸树胚性愈伤组织的分化率为0.00%,存活率仅为5.71%,因此确定60 mg·L~(-1)为遗传转化的选择压。采用正交设计L18(37)进行农杆菌介导的楸树遗传转化试验,通过GUS化学组织染色统计瞬时表达率,正交试验直观分析和单因素方差分析结果表明:在预培养时间为2天,采用农杆菌菌株EHA105、菌液浓度OD600值为0.7、添加乙酰丁香酮(AS)浓度为300μmol·L~(-1)、侵染时间为10 min,共培养时间为5天的条件下,农杆菌介导的转化效率最高,且对转化效率影响最大的2个因素是乙酰丁香酮浓度和预培养时间。对浸染后的胚性愈伤组织进行8个月的筛选培养,共获得32个抗性组织团,对其中15个增殖较多的抗性愈伤组织进行PCR检测,表明86.67%的抗性组织团中有外源基因整合到楸树基因组中。内源激素水平会对植物体细胞胚分化产生影响,细胞分裂素(CTK)和脱落酸(ABA)促进体胚发生,生长素(IAA)和赤霉素(GA)对体胚发生有抑制作用。通过测定内源激素可知,转基因的抗性组织中内源CTK和ABA水平显著低于野生型的楸树胚性愈伤组织,而内源IAA和GA则显著高于野生型胚性愈伤组织,推测内源激素水平可能是转基因抗性组织体胚分化能力比较差的原因。【结论】建立了农杆菌介导的楸树胚性愈伤组织的遗传转化体系,对筛选获得的15个抗性愈伤组织进行PCR检测,其中13个抗性愈伤组织中有外源基因的整合。内源激素水平的变化可能是导致楸树转基因抗性愈伤组织难以分化的原因。

为探究马铃薯的最佳遗传转化体系，以紫色马铃薯‘华颂66号’无菌组培苗茎段为外植体，用农杆菌介导法将含有植物沉默载体质粒pBWA(V)KS-miR8019转化马铃薯外植体，测定不同预培养时间、不同激素组合及抗生素对马铃薯愈伤再生转化体系的影响。结果表明：1）茎段预培养时间为2 d时，愈伤组织诱导率最高；2）最适的外植体愈伤组织诱导的培养基配方为：MS干粉式培养基+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D，愈伤组织的诱导率为96.7%。最适愈伤组织分化的培养基为：MS干粉式培养基+4.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L GA_3;3）植株再生及生根的抗生素最适筛选浓度为75 mg/L的卡那霉素；4）农杆菌抑制剂的最适浓度为300 mg/L的特美汀，且在愈伤组织诱导、分化及生根阶段都需要加入。综上，通过对农杆菌介导的愈伤再生转化过程中各个影响因素进行试验，初步建立了马铃薯‘华颂66号’的遗传转化体系。

为建立地被菊‘中国红’的再生和遗传转化体系，以其无菌苗叶片为外植体，通过添加不同浓度的生长调节剂，研究其对诱导愈伤组织、不定芽的影响，并利用根瘤农杆菌介导法对地被菊‘中国红’叶片进行遗传转化，研究影响菊花转化的若干因素，建立一套高效的遗传转化体系。结果表明：地被菊‘中国红’在ＭＳ＋２．０Ｍｇ·Ｌ－１６－ＢＡ＋０．２Ｍｇ·Ｌ－１ＮＡＡ的培养基上获得了最高的不定芽分化率（８９．６％）；地被菊‘中国红’的最适生根培养基为１／２ＭＳ＋０．３Ｍｇ·Ｌ－１ＮＡＡ，生根率达１００％；其叶片外植体的遗传转化条件：ＯＤ６００＝０．６、农杆菌侵染时间为７ＭｉＮ、共培养４８ｈ、延迟培养２Ｄ、卡那霉素筛选浓度为１５Ｍ．．．

为研究叶用莴苣中Hsp70基因的功能,以提高其耐热性,构建LsHsp70-3701过表达载体,农杆菌介导法转化叶用莴苣。从叶用莴苣中克隆得到LsHsp70-3701,利用NcoⅠ和SpeⅠ双酶切LsHsp70-3701和植物表达载体pCAMBIA1304,回收目的片段并连接,经鉴定后获得过表达载体。以‘P-S11'叶用莴苣为转化材料,针对遗传转化关键因素:苗龄、植物激素浓度、预培养时间、侵染液OD值、侵染时间和共培养时间进行优化。试验结果表明最佳转化条件为:苗龄5d的子叶,6-BA 0.2mg/L+NAA

【目的】优化杜仲叶片愈伤组织的再生体系,研究愈伤组织对抗生素和抑菌剂的敏感性,探索影响农杆菌介导杜仲愈伤组织遗传转化的最适转化因子水平,构建农杆菌介导的杜仲愈伤组织瞬时转化体系,使杜仲成年植株外植体为受体的遗传转化成为可能,为杜仲基因功能的研究与定向改良奠定基础。【方法】以杜仲成年植株叶片为材料诱导愈伤组织,通过添加不同浓度植物生长调节剂与大量元素的MS培养基进行不定芽的诱导与增殖,确定最适培养基。在此基础上,在培养基中添加不同浓度抗生素及抑菌剂,研究愈伤组织对其敏感性。以获得的叶片愈伤组织受体系统为基础,通过L_(16)(4~5)的正交试验,探索不同转化因子对农杆菌介导叶片愈伤组织遗传转化的瞬时转化效率的影响,建立最适瞬时转化体系。使用获得的瞬时转化体系对愈伤组织进行遗传转化操作,筛选抗性芽,对抗性芽进行GUS组织化学染色与PCR检验。【结果】再生体系优化的结果表明,3/4大量元素浓度的MS培养基能够促进杜仲愈伤组织不定芽的诱导及生长;愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS+0. 27μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,诱导率为83%±10. 0%;不定芽复壮的最适培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,平均伸长长度为(2. 47±1. 33) cm。抗生素与抑菌剂敏感性试验表明,遗传转化的选择培养基中,抑菌剂头孢霉素的最适浓度为200 mg·L~(-1),筛选用的抗生素卡那霉素最适浓度为70 mg·L~(-1)。转化因子的正交试验表明,最适的农杆菌介导杜仲叶片愈伤组织遗传转化的转化因子组合为:预培养5天、侵染10 min和共培养3天。使用最适瞬时转化体系对约200个愈伤组织进行遗传转化操作,共筛选获得3个抗卡那霉素的抗性芽; GUS组织化学染色显示GUS基因在抗性芽中得到了表达,PCR检测证明这些抗性芽中存在NPTⅡ基因。【结论】杜仲叶片愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS+0. 27μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,不定芽复壮的最适培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA。农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织瞬时转化体系为:预培养5天、侵染10 min和共培养3天,筛选培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA+200 mg·L~(-1)Cef+70 mg·L~(-1)Km。利用此体系共获得3个抗性芽,PCR分析和GUS组织化学染色都表明T-DNA已整合到抗性芽基因组中。

【目的】炭疽菌属(Colletotrichum spp.)病原菌主要引起茶树叶部炭疽病害。为了降低茶树受到炭疽菌的侵害,从而防控茶树炭疽病,作者进行了病原菌的分离鉴定和遗传体系的建立。【方法】对福建省的政和县、福州市、福安市和宁德市不同茶产区的茶树炭疽病病叶采用单孢分离法分离病原菌,对分离得到的菌株采用形态学结合分子鉴定方法(rDNA-ITS序列)进行鉴定。为深入研究其致病性机理,将含有潮霉的抗性标记基因片段和融合有绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein)GFP基因的Histone 1片段的质粒pCZ007,采用聚乙二醇PEG-CaCl_2介导法,转化茶树胶胞炭疽病原菌。【结果】从4个地区共分离得到致病炭疽菌12株,并进行观察和测定。发现引起茶树炭疽病的胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)是优势菌株,并成功建立的该茶树胶孢炭疽菌的遗传转化体系,随机挑取的4个经分子验证的转化子均能观察到定位于细胞核的绿色荧光和具有抗潮霉素的特性,随后的多次传代均能够稳定观察到绿色荧光定位信号。【结论】本研究分离并经形态学结合分子检测鉴定了福建省4个茶产区的茶树炭疽病的主要病原菌为胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides),成功建立能稳定表达目的基因的遗传转化体系,为后续深入研究茶树炭疽菌相关关键致病功能基因的分子机制提供新的线索,运用绿色荧光蛋白观察茶树胶孢炭疽菌对茶树叶片的侵染过程奠定基础。

Micro-Tom番茄植株矮小,生长密度高,生命周期短,转化效率高,成为功能基因组学研究的新型模式植物。对影响Micro-Tom遗传转化频率的共培养时间、AS的添加、工程菌液浓度和抑制农杆菌所用抗生素种类进行了分析,建立了Micro-Tom稳定高效的遗传转化体系。以bar基因设计引物对转化群体进行PCR检测,阳性率为72.3%,平均插入位点数为1.8个。遗传体系的建立为Micro-Tom在植物生物学研究中提供理论基础。

【目的】为建立农杆菌介导的柳枝稷高效再生及遗传转化体系。【方法】试验以柳枝稷品种ＡｌＡｍｏ、Ｐｅｒｆｏｒｍｅｒ及ＢｌＡｃｋｗｅｌｌ的成熟种子为外植体诱导愈伤组织。愈伤诱导６周后，借助解剖镜观察愈伤形态，去除愈伤组织外层含水量大、海绵状愈伤组织，挑选位于愈伤组织中心位置的核状、紧实型愈伤置于继代培养基培养。暗培养３周后，在解剖镜下挑选结构松脆、生长旺盛的愈伤组织按细胞系继代增殖培养。该类愈伤组织易于分化，属单子叶植物愈伤组织分类中的第Ⅱ型。经两次继代增殖培养后，可以获得足够的愈伤组织进行再生和遗传转化研究。为优化柳枝稷Ⅱ型愈伤组织的农杆菌侵染流程，试验比较了３种农杆菌侵染流程下的转基因效率。真空．．．

以磨盘柿叶片为外植体,通过农杆菌介导法,建立了ACC合成酶基因(ACS)遗传转化体系。研究了预培养时间、农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间和乙酰丁香酮(AS)浓度等因素对基因转化的影响。结果表明:适宜的预培养时间为2 d;用OD600值为1.0的菌液侵染15 min、共培养3 d,AS浓度200μmol/L有利于提高转化频率。经PCR分子检测,初步确定ACC合成酶基因已转入磨盘柿组培苗中。