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[期刊] 渔业科学进展
[作者]
孙晶晶 高晓建 张晓君 马丽娜 阎斌伦 白雪松 赵佳铭 毕可然 秦蕾
本研究检测了分离自发病大菱鲆、半滑舌鳎及鲤鱼的22株病原鳗弧菌(Vibrio anguillarum)毒力相关基因的携带情况,并建立了病原鳗弧菌的分子生物学检测方法。以PCR方法检测8个毒力相关基因的分布,结果显示,22株病原鳗弧菌均可扩增出6个基因(emp A、vah1、vah4、fla A、rtx A和ton B)目的条带,未扩增出vir A和ang M基因;针对vah4和rtx A设计引物进行双重PCR扩增,同一PCR反应体系可扩增出两条目的条带,灵敏度为2.4×103 CFU/ml,对照菌无任何扩增条带;以vah4设计引物进行LAMP扩增,病原鳗弧菌可扩增出阶梯状条带,呈现阳性反应,6...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
孙晶晶 高晓建 张晓君 马丽娜 阎斌伦 白雪松 赵佳铭 毕可然 秦蕾
本研究检测了分离自发病大菱鲆、半滑舌鳎及鲤鱼的２２株病原鳗弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）毒力相关基因的携带情况，并建立了病原鳗弧菌的分子生物学检测方法。以ＰＣｒ方法检测８个毒力相关基因的分布，结果显示，２２株病原鳗弧菌均可扩增出６个基因（ｅｍＰａ、Ｖａｈ１、Ｖａｈ４、ｆｌａａ、ｒｔｘａ和ｔｏｎｂ）目的条带，未扩增出Ｖｉｒａ和ａｎｇｍ基因；针对Ｖａｈ４和ｒｔｘａ设计引物进行双重ＰＣｒ扩增，同一ＰＣｒ反应体系可扩增出两条目的条带，灵敏度为２．４×１０３ Ｃｆｕ／ｍｌ，对照菌无任何扩增条带；以Ｖａｈ４设计引物进行ｌａｍＰ扩增，病原鳗弧菌可扩增出阶梯状条带，呈现阳性反应，６株对照菌无阶梯．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
张晓君 白雪松 毕可然 阎斌伦 秦蕾 陈丽 徐静
为明确牙鲆及大菱鲆病原迟钝爱德华菌毒力基因的携带情况并建立分子检测方法,实验以迟钝爱德华菌fimA、fimB、gadB及citC为靶基因设计特异性引物,进行PCR扩增及环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),并对其特异性、灵敏性和实际应用进行了比较。结果显示,10株病原迟钝爱德华菌均扩增出fimA、fimB、gadB及citC 4种毒力基因,目的条带大小分别为240、217、171及119 bp,4株对照菌无任何扩增条带;以fimA和gadB设计的两对引物进行的双重PCR扩增,同一PCR反应体系中病原迟钝爱德华菌可扩增出240和...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
刘衍鹏 黄冠军 刘天强 李爱华 肖丹
根据弧菌属细菌(Vibrio spp.)共有的rpo A基因序列,比对和设计了一对PCR引物,建立了能够快速而准确地检测弧菌属细菌的通用PCR检测方法,该方法对靶标DNA的检测灵敏度为58 fg/μL,对菌液的检测灵敏度为2.7×102cfu/m L,能够区分该属细菌与其它属的细菌,具有极高的特异性。使用建立的方法对分离自南美白对虾的病原菌进行了检验,并结合16S r DNA序列分析,结果显示待检测病原均为弧菌属的细菌,与测序结果一致,说明该检测方法可用于弧菌属细菌的检测和诊断。
关键词：
弧菌属细菌 rpo A基因 特异性 检验
[期刊] 海洋渔业
[作者]
于劼豪 黄郁葱 孙良娟 钟键 鲁义善 简纪常 蔡双虎
为加强对哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）早期快速诊断，本研究探究建立一种基于环介导等温扩增（LAMP）技术的可视化快速检测方法。基于环二聚体磷酸二酯VieA基因序列在哈维氏弧菌中的保守性，将其作为靶基因设计引物并初步建立LAMP反应体系，对LAMP反应体系中各反应物浓度、内外引物比例、反应时间和反应温度进行优化，并对优化后的LAMP反应的特异性和灵敏度进行检测；分别在优化后的LAMP反应体系中加入SYBR Green I、钙黄绿素-锰离子或羟基萘酚蓝作为指标剂对LAMP反应产物进行可视化判别，从而建立了一种针对哈维氏弧菌的LAMP可视化检测方法。研究表明该LAMP反应体系最佳反应温度60℃、反应时间60 min、Mg~(2+)浓度1.2 mmol·L~(-1)、dNTPs浓度0.64 mmol·L~(-1)、甜菜碱浓度0.25 mmol·L~(-1)及内外引物比例16:1；该反应体系能特异性检测到哈维氏弧菌，且灵敏度为3.4×10~(-6 )ng·μL~(-1)。可视化指标剂钙黄绿素-锰离子的添加比例为12:1或羟基萘酚蓝的添加浓度为390 μmol·L~(-1)时LAMP反应结果的可视化效果最好，临床应用表明该LAMP可视化技术能准确并特异性地检测到珍珠龙胆石斑鱼和凡纳滨对虾组织中感染的哈维氏弧菌。本研究提供了一种简单、快速和结果可视化的哈维氏弧菌LAMP检测方法，可以为水生动物哈维氏弧菌的现场检测和弧菌病的早期诊断提供技术支持。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
涂志刚 杨海朋 崔婧 严耿杰 李丹萍 周永灿 邱名毅
哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是引起海南省后水湾深水网箱养殖卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)"烂身病"的主要病原菌。为了能够快速诊断该病原菌,急需建立一种耗时短、准确以及便捷的检测方法。本研究利用分离到的致病菌株QT520的ToxR基因序列设计特异性引物和加入SYTO-9特异荧光染料,建立了一种可以实时、快速检测哈维氏弧菌的LAMP法(RT-LAMP)。该方法对哈维氏弧菌的基因组DNA及菌液灵敏度分别为100 fg/μL和10~3 cfu/mL,与Real-time PCR法检测灵敏度相当,比普通PCR的检测灵敏度要分别高1000倍和10倍,能有效区分哈维氏弧菌与坎氏弧菌(Vibrio campbellii);可以实时观察检测结果,且检测时间只需要40 min;具有耗时短、特异性和灵敏度高、仪器便携、操作简单且能实时观察检测结果等优点,非常适合在生产现场进行哈维氏弧菌的检测。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
刘晓丹 肖自东 孙威 李席席 周一凡 张晓君
根据NCBI已发表的维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)促旋酶B亚单位基因gyrB和编码细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的保守序列设计引物,建立了一种快速检测青虾源维氏气单胞菌的双重PCR检测方法。结果显示:青虾源维氏气单胞菌gyrB和rpoD基因PCR扩增产物大小分别为815 bp、554 bp,而对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、哈维弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、需钠弧菌(Vibrio natriegens)、非O1霍乱弧菌(non-O1 Vibrio cholerae)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)扩增结果皆为阴性;灵敏性试验结果显示该方法检测到的最低菌体DNA量为1.8×10~(-2) ng/μL,且10份送检样本检测结果与传统细菌分离鉴定结果相一致。结果表明,双重PCR检测方法特异性好、灵敏性高,适用于青虾源维氏气单胞菌的快速检测。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
张晓君 姚东瑞 阎斌伦 秦蕾 毕可然 梁利国
基于霍乱弧菌lolB基因保守序列设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测霍乱弧菌的方法。常规PCR检测仅霍乱弧菌扩增出大小为519bp的目的片段,其他3种病原弧菌均为阴性;SYBR GreenⅠ实时定量PCR,在Tm为86.5～87℃,扩增产物的熔解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,表明该引物具有较好的特异性。SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增曲线反映了PCR的指数增长阶段和平台阶段;所制作的标准曲线在2.59×108～2.59×100拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.993,能对霍乱弧菌进行准确的定量分析。该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4～...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
韩广涛 杨志辉 朱杰华 赵冬梅 韩彦卿
【目的】利用双重PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌(Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus)和黑胫病菌(Pectobacterium atroseptica)。【方法】根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列,对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列,设计并合成了1对特异性引物CMS1/CMS2,将设计的引物与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r结合,经过条件优化后,建立了双重PCR体系。【结果】利用引物CMS1/CMS2扩增出了1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带。检测灵敏度...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
潘晓艺 沈锦玉 郝贵杰 姚嘉贇 徐洋 尹文林 孙逢明 吴颖蕾
针对GenBank中登录的气单胞菌属(Aeromonas)的毒力基因甘油磷脂胆固醇酰基转移酶基因(GCAT)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的16SrRNA基因的保守区设计2对特异性引物。通过进行双重PCR反应体系优化,PCR产物的测序鉴定和特异性试验,建立了一种能同时检测气单胞菌(Aeromonasspp.)和嗜水气单胞菌的双重PCR检测方法。用此方法对5株嗜水气单胞菌、7株其他不同种的气单胞菌和5株非气单胞菌属菌株进行双重PCR检测。结果显示,气单胞菌和嗜水气单胞菌在GCAT基因的扩增区都能得到有效扩增,其中嗜水气单胞菌能同时在16SrRNA基因扩增区得到有效扩增...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
黄雯 徐进 张昊 许景升 丁伟 冯洁
【目的】由茄科雷尔氏菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａＲｕｍ，简称青枯菌）引起的青枯病（ｂａｃｔｅＲｉａｌ ｗｉｌｔ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ）是世界范围内危害最为严重的土传细菌病害之一，严重制约了多种经济作物的生产。建立高效、精准的早期诊断技术，是实现青枯病有效防控的基础。论文旨在建立一种能够特异检测青枯菌的环介导等温扩增方法（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅＲｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｌａｍｐ），实现青枯菌的田间快速检测。【方法】通过比对分析青枯菌的ｌｐｘ ｃ基因序列，并利用在线引物设计软件ｐＲｉｍｅＲ ｅｘｐｌｏＲｅＲ ＶｅＲｓｉｏｎ ４．０得到４条ｌａｍｐ特异性引物．．．
关键词：
青枯菌 检测 环介导等温扩增
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
孙国荣 马少鸿 林桂香 万小菊 黄郁葱 简纪常 蔡双虎
基于荚膜多糖cpsA基因设计引物，建立海豚链球菌可视化环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术，以快速检测鱼类养殖中的海豚链球菌。结果表明，LAMP最佳反应条件为65 ℃反应20 min，镁离子浓度为1.2 mmol/L、dNTPs浓度为0.64 mmol/L、内外引物比例为 16:1；特异性检测结果表明：该方法能特异性检出海豚链球菌，对无乳链球菌和其他14种菌检测结果均呈阴性；灵敏度检测结果表明，该LAMP方法灵敏度为21.2×10~(-6) ng/μL，比PCR检测方法灵敏度高100倍；适用性分析结果表明，该LAMP方法在模板中存在鱼类基因组干扰下也能正确完成检测。研究中建立的LAMP检测方法为海豚链球菌的检测提供一种可视化、灵敏、成本低的快速检测技术。
关键词：
海豚链球菌cpsA LAMP 可视化检测
[期刊] 华北农学报
[作者]
王永 赵新 景海春 兰青阔 朱珠 程奕
以无乳链球菌纤连蛋白fbs基因为主要研究对象,采取环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对fbs基因的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)在63℃保温1 h,通过荧光显色即可完成对无乳链球菌的检测工作。结果显示,LAMP方法能够特异性检测fbs基因,其检测灵敏度是常规PCR方法的100倍,并与实时荧光定量PCR方法相当。所建立的针对无乳链球菌fbs基因的LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合无乳链球菌的快速检测。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
何苹萍 赵永贞 陈秀荔 张彬 黄婷 彭敏 杨春玲 杨彦豪 李咏梅 邵朋威 陈晓汉
研究基于哈氏弧菌HSP60基因序列设计1对特异性引物,通过优化PCR条件,特异性及敏感性检测,建立了一套哈氏弧菌特异性PCR检测方法。结果表明,该PCR检测方法可使分离自患病南美白对虾的哈氏弧菌扩增出238 bp的HSP60基因片段,其他五种对照病原弧菌未扩增出任何条带;检测方法最低能检测出2.1 pg的哈氏弧菌基因组DNA。表明建立的哈氏弧菌PCR检测方法可用于该菌引起的水产动物疾病的快速诊断。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
李晨 王秀华 黄倢
根据目前水产上常见病原菌鳗弧菌Vibrio anguillarum、嗜水气单胞菌Aeromonas hy-drophila、迟缓爱德华氏菌Edwardsiellatarda的毒力相关基因,选择具有特异性的鳗弧菌调控毒力蛋白表达的toxR(Positive transcriptional regulator)基因、嗜水气单胞菌中重要的编码气溶素(Aero-lysin)基因aerA、迟缓爱德华氏菌中编码分泌系统装置蛋白的基因evpA,分别设计1对特异性引物,建立可同时特异性地检测3种菌的多重PCR检测体系。对反应条件进行优化并测试了其特异性和灵敏度。实际样品检测证明,此多重PCR体系具有良好的可靠...
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