WRKY转录因子是植物中特有的转录因子家族之一，研究证实WRKY转录因子在植物的生长发育及对生物与非生物胁迫响应中具有重要的调控作用。为揭示番茄WRKY基因的功能，基于前期转录组数据，以番茄高抗青枯病Hm 2-2(R)与高感青枯病BY 1-2(S)2个自交系株系为试验材料，克隆得到1个番茄WRKY转录因子SlWRKY75基因(Solyc05g015850.3)。通过生物信息学分析、氨基酸序列多重比对、系统发育树构建、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和病毒诱导的基因沉默(VIGS)等技术方法对其基因及编码蛋白的结构、表达模式与功能进行分析。结果表明，该基因的cDNA全长为653 bp,其最大开放阅读框为519 bp,编码172个氨基酸，其蛋白相对分子量为19.878 51 ku,理论等电点为9.32,属于亲水性非分泌蛋白，且不存在跨膜结构，同时，该蛋白具有1个高度保守的WRKY结构域和一个CX_4CX_(23)HXH锌指基序，且同属于第Ⅱ类家族。系统发育树分析表明，SlWRKY75与潘那利番茄SpWRKY75亲缘关系最近，并与其他茄科聚为1组，而与橡胶树HbWRKY75、陆地棉GhWRKY75等的亲缘关系较远，在系统发育树上处于不同的分支。qRT-PCR结果表明，SlWRKY75基因的表达具有组织特异性，并可被青枯菌、水杨酸和茉莉酸所诱导。利用VIGS技术得出，沉默SlWRKY75降低了植株对青枯病的抗性，表明SlWRKY75正调控番茄对青枯病的抗性。通过以上研究结果得出，SlWRKY75基因在番茄调控青枯病抗性响应过程中扮演着重要的角色。

为进一步明确该基因的分子特征及表达特性,通过RT-PCR从番茄中克隆了低温响应NAC转录因子SlNAC80,该基因开放阅读框1 023 bp,编码340个氨基酸。Sl NAC80蛋白相对分子量为38.19 k Da,等电点为5.27,N-端具有典型的NAC保守结构域,包含A、B、C、D、E 5个亚结构域。实时荧光定量PCR(q PCR)分析表明,Sl NAC80在番茄各组织中均有表达,以在绿果和衰老叶中的表达量最高,在红熟果中的表达量最低。对启动子区序列进行预测分析发现,Sl NAC80启动子区含有许多响应激素(ABA、GA、SA及ETH)和逆境(低温、脱水及盐胁迫)的顺式作用元件,如EREL...

为了研究番茄ＳｌＹＡＢ２Ａ基因的功能及其在番茄生长发育中的分子机理，以番茄的ｃＤＮＡ为模板，利用ＲＴＰｃＲ技术从番茄中克隆到ＳｌＹＡＢ２Ａ基因，该基因编码的蛋白质由１９２个氨基酸残基组成，蛋白质的分子量为２１．３５ｋ ＤＡ，等电点是８．７９，平均亲水系数是－０．４８７。ＳｌＹＡＢ２Ａ蛋白质的６～１６５位氨基酸残基形成ＰｆＡｍ：ＹＡＢＢＹ结构域，在２０～４７位有１个ｃ２ｃ２锌指结构域，在１２２～１８１位有１个螺旋－环－螺旋结构域。二级结构分析表明ＳｌＹＡＢ２Ａ蛋白分子中，α－螺旋占１９．７９％、β－折叠占１４．０６％、其余６６．１５％为不规则卷曲。蛋白多序列比对表明ＳｌＹＡＢ２Ａ与马铃薯、林烟草．．．

【目的】克隆甜高粱WRKY基因,分析其序列特征和表达谱,为甜高粱抗旱育种提供基因来源。【方法】以甜高粱品种M81-E幼苗总RNA为模板,利用RT-PCR技术克隆甜高粱WRKY基因,通过生物信息学软件分析其序列特征,采用实时荧光定量PCR检测基因表达情况,获得2条WRKY基因,命名为SbWRKY1(Genebank登录号:KY231904)和SbWRKY2(Genebank登录号:KY231905)。【结果】SbWRKY1 cDNA序列全长1086 bp,包括1个1059 bp的开放阅读框,编码352个氨基

【目的】克隆获得番茄 SYTA (Solanum lycopersicum SYTA，S.l SYTA),分析其基因序列生物信息学特征和预测蛋白的结构特征,明确S.l SYTA亚细胞定位和组织表达,并分析其在绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染下的表达变化及其对TMV移动的影响,为明确S.l SYTA在植物病毒侵染致病过程中的作用提供理论依据。【方法】根据番茄基因组含有的SYTA同源基因序列,

根据GeneBank中已登记的番茄果糖激酶基因的保守序列设计特异引物,以普通栽培型番茄辽园多丽的果实为材料提取总RNA,采用RT-PCR方法,扩增出果糖激酶基因cDNA序列的部分片段并克隆到pBS-T载体中。测序结果表明,LeFRK1-LeFRK3分别与番茄植物中已知该基因的核苷酸序列相似性高达99%以上,构建了一个番茄、马铃薯、烟草及拟南芥植物中FRK基因的系统进化树。采用半定量RT-PCR方法对番茄果实不同发育时期的表达进行检测,FRK1-FRK3在番茄果实发育的过程中均有表达,但在花后25～35 d时表达量较高。

为了解ABA对果实发育和成熟的调控作用,对与ABA合成相关的LeNCED2基因进行了克隆与分析。采用RT-PCR和RACE技术从番茄品种‘嘉宝’(Solanum lycopersicum cv.Jiabao)果实中克隆得到了一个LeNCED1基因的同源片段,定名为LeNCED2(基因库注册号:EU912387)。该基因3′端序列为1635bp,与LeNCED1基因的DNA序列同源性为72.7%,与马铃薯中的StNCED2基因(AY662343)碱基序列同源性高达95%。碱基序列推导的蛋白序列与LeNCED1基因的同源性为80%。RT-PCR分析显示LeNCED2基因在番茄植株的根、茎、叶、花和...

为阐明巴西橡胶树WRKY转录因子基因Hb WRKY41的分子特征及表达特性,利用RT-PCR方法从巴西橡胶树中克隆了该基因。Hb WRKY41开放阅读框1 020 bp,编码339个氨基酸,预测蛋白分子量为38.48 k Da,理论等电点为5.52。Hb WRKY41含有1个WRKY保守结构域和1个C_2HC型锌指结构,与蓖麻、棉花、大豆及拟南芥WRKY41蛋白聚为一类,属于Ⅲ类WRKY转录因子家族成员。实时荧光定量PCR检测结果表明,Hb WRKY41在巴西橡胶树根、树皮、胶乳、叶和花等组织中均有表达,

【目的】WRKY是植物特有的一类转录因子,在生理调控和逆境响应过程中有着重要作用。通过分析WRKY转录因子基因在甘蔗生长发育及抗逆境过程中的作用,为甘蔗抗逆分子育种提供优良的基因资源。【方法】从甘蔗转录组数据库中挖掘到一条WRKY基因Unigene序列,并通过RT-PCR扩增得到cDNA全长序列,利用ORF finder、Smart、ExPaSy、Prabi、NetPhos、Cell-PLOC 2.0和DNAMAN6.0软件对该基因序列及其编码蛋白序列进行生物信息学分析,并使用MEGA6.0软件构建系统进化树;构建pCAMBIA1300-WRKY-GFP融合表达载体,通过农杆菌转化本氏烟(Nicotiana benthamiana),确定WRKY蛋白在烟草叶片中的亚细胞定位;利用酵母杂交试验验证WRKY是否具有转录自激活活性;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析WRKY在甘蔗品种ROC22中的组织特异性(根、蔗芽、叶、蔗髓和皮)及其在MeJA(100μmol·L-1)、SA(5 mmol·L-1)、PEG(25%)、NaCl(250 mmol·L-1)、CuCl2(500 mmol·L-1)和CdCl2(500 mmol·L-1)胁迫条件下表达量的变化。【结果】从甘蔗品种ROC22中克隆获得一个WRKY转录因子基因,命名为ScWRKY6(GenBank登录号为MH393927)。该基因序列全长1 289 bp,包含1个1 059bp的ORF,编码352个氨基酸,并具有45个磷酸化位点;理论等电点为9.73,不稳定指数为50.23,亲水性为-0.579,推测其为碱性不稳定亲水性蛋白。ScWRKY6蛋白具有1个WRKY结构域和1个锌指结构域(CX5CX23HXH),该蛋白氨基酸序列与高粱(Sorghum bicolor)WRKY(XP_002464211.1)的同源性最高,根据系统进化树分析可以推测其属于WRKY家族Ⅱd亚类。亚细胞定位结果显示,ScWRKY6::GFP融合蛋白定位在细胞核上。酵母转录激活验证试验显示,ScWRKY6蛋白不具有转录自激活活性。qRT-PCR分析表明,ScWRKY6在甘蔗中为组成型表达,其表达量由大到小依次为蔗芽、叶、根、皮和蔗髓,其中蔗芽、叶和根的表达量分别为蔗髓的2.05、1.55和1.37倍。ScWRKY6在NaCl、PEG、MeJA、重金属Cu2+和Cd2+胁迫诱导下表达量均上调,其在NaCl处理12 h时表达量最高,为对照的4.18倍;在PEG处理3 h时表达量最高,为对照组的6.88倍;在CuCl2和CdCl2诱导24 h时表达量最高,分别为对照组的3.63倍和4.86倍。【结论】ScWRKY6蛋白定位在细胞核上,不具有转录自激活活性;该基因在甘蔗不同组织部位中均有表达,且受NaCl、PEG、CuCl2和CdCl2等胁迫的诱导,推测ScWRKY6可能在甘蔗干旱应答、耐盐及金属离子胁迫响应中发挥作用。

为深入研究褪黑素的分子生物学功能,根据番茄基因组数据库的SlSNAT基因序列信息设计引物,以耐盐番茄材LA1401(PI365967)叶片RNA反转录得到的cDNA为模板,利用高保真酶克隆了番茄的褪黑素合成酶基因SlSNAT,基因CDS(coding sequence)序列全长为768 bp,共编码255个氨基酸。利用酶切连接的方法,构建了该基因的超表达载体。实时定量PCR结果表明,SlSNAT基因在叶片中的表达量最高,显著高于其在花、果实、根、种子和萼片中的表达量。在不同非生物逆境处理下的表达结果显示,在干旱处理条件下的表达量最高,其次是在甘露醇的渗透胁迫逆境,在这2种胁迫条件下的表达量均显著高于其在过氧化氢、氯化钠、低温和褪黑素诱导下的表达量。另外,在盐胁迫条件下,SlSNAT基因在根部的表达量受到明显抑制。

钙调蛋白是植物体内一种重要的Ca~(2+)受体蛋白，在钙信号途径及抗逆反应中发挥着重要作用。为研究番茄CaM蛋白在低温胁迫下的作用机制，以番茄品种Heinz1706、LA3969、冀粉2号、冀粉3号和农博粉霸15为材料，克隆得到了番茄钙调蛋白基因SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5,并进行序列分析和启动子区顺式作用元件分析；利用qRT-PCR技术分析SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5在不同番茄品种中15,5℃低温胁迫下的表达模式，并结合RNA-seq数据分析组织特异性表达情况。结果显示，SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5的CDS序列均为450 bp,三者相似度为93.63%;所编码的氨基酸序列完全相同，属酸性稳定亲水蛋白，具有典型的CaM蛋白保守结构域。启动子顺式作用元件分析表明，3个基因的启动子区除含有必需的核心元件外，还含有多种生物及非生物胁迫响应元件，并呈现互补模式分布。不同程度低温胁迫表达模式分析表明，15℃胁迫下，SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在5种番茄材料中的表达模式均呈现出先降低后升高的趋势，其中SlCaM5基因的表达量升高更为显著；5℃胁迫下，SlCaM3、SlCaM4基因的表达水平变化不明显，而SlCaM5基因在处理后期表达量显著升高；表明SlCaM5在低温下维持着CaM蛋白的翻译水平。SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在Heinz1706不同组织中的特异性表达情况显示，SlCaM3和SlCaM4在分生组织中具有较高的表达，而SlCaM5基因在不同组织中表达水平差异不明显。

为解析番茄乙烯受体基因SlETR6在非生物胁迫过程中的功能。以番茄为材料,克隆了番茄SlETR6基因,利用MEGA 5. 0软件对SlETR6基因编码的蛋白进行了聚类分析,并利用实时荧光定量PCR分析了SlETR6基因在番茄根、叶、花、果实不同发育时期的组织表达情况及对其在高盐、高温(40℃)、低温(4℃)、干旱胁迫条件下的表达模式。结果表明,SlETR6基因开放阅读框(Open reading frame,ORF)为2 265 bp,编码754个氨基酸,蛋白质分子质量为85. 05 ku,等电点为7. 28,与马铃薯St ETR-like蛋白的同源性最高;启动子分析显示,SlETR6基因含有热胁迫、干旱胁迫、低氧胁迫、光响应、乙烯、水杨酸及赤霉素应答等相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,SlETR6在番茄不同组织中均有表达,且在花和转色期果实中有显著高表达。高盐胁迫6 h后,SlETR6基因呈现上调表达,12 h后达到峰值,而后回复正常表达水平;高温胁迫后,SlETR6基因表达量有明显的上升趋势;干旱胁迫早期SlETR6基因应答强烈,在胁迫处理1 h后表达量达到峰值。因此,推测SlETR6基因可能在番茄适应高盐、高温、干旱等逆境胁迫过程中发挥重要作用,可能参与番茄生长发育过程中的逆境调控。为番茄抗逆研究提供了新的候选基因资源。

为制备番茄褪绿病毒（ＴｏｍａＴｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ，Ｔｏ ｃｖ）抗血清，以番茄病叶为试验材料，提取总ｒＮａ，根据Ｔｏ ｃｖ ｃＰ基因设计特异性引物，利用ｒＴ－Ｐｃｒ方法克隆目的基因，构建原核表达载体Ｐ ＥＴ３２ａ－Ｔｏ ｃｖｃＰ，在大肠杆菌ｒｏｓＥＴＴａ（ＤＥ３）菌株中表达ｃＰ蛋白。结果表明：Ｔｏ ｃｖ ｃＰ基因（ＧＥＮ ＢａＮｋ登录号：ｋＴ８０９４００）全长７７４ ＢＰ，编码２５７个氨基酸，与ＧＥＮ ＢａＮｋ中其他地区分离物核苷酸序列同源性为９７．２％～９９．６％，推导的氨基酸序列同源性为９７．３％～１００．０％。核苷酸序列保守位点占全部位点的９１．３％，氨基酸序列保守位点占全．．．

为研究ＦａＧａＭＹＢ基因在草莓成花诱导和花发育中的作用，以‘卡姆罗莎’草莓（ＦｒａＧａｒｉａ×ａｎａｎａｓｓａ Ｄｕｃｈ．‘ｃａＭａｒｏｓａ’）为试材，采用同源克隆和ｒＴ－Ｐｃｒ技术分离了一个赤霉素信号途径中的ＭＹＢ转录因子基因ＦａＧａＭＹＢ。该基因开放阅读框为１ ６８９ＢＰ，编码５６２个氨基酸。序列分析发现ＦａＧａＭＹＢ蛋白含有高度保守的ｒ２ｒ３Ｄｎａ结合域，以及ＧａＭＹＢ基因家族所特有的Ｂｏｘ１，Ｂｏｘ２和Ｂｏｘ３保守区域。亚细胞定位研究发现ＦａＧａＭＹＢ蛋白定位于洋葱表皮细胞的细胞核。ＦａＧａＭＹＢ基因具有组成型表达特性，但在雄蕊、花芽、茎尖生长点和果实等生殖生长组织与器官的表达丰度较高．．．

为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式，以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材，利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位，克隆到HvnANT1基因，对其进行生物信息学分析。结果表明：1）在7H染色体的84.30—86.00cM获得1个MYB类转录因子，命名为HvnANT1。2）该基因长1 033bp，其完整开放阅读框为762bp，编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14kU，是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构，无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成，具有2个SANT结构域（分别位于第13—第63个；第66—第114个氨基酸）。3）同源比对与系统进化分析表明：青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%；这些序列都具有2个高度保守的2个SANT结构域；与大麦的亲缘关系最近，其次是与乌拉尔图小麦，与水稻最远。4）亚细胞定位结果表明，该基因定位在细胞核内。5）实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示：与籽粒颜色形成的乳熟早期和乳熟晚期相比，软面团期的HvnANT1基因在‘涅如姆扎’中表达量极显著上调，而在‘昆仑10号’中各时期的表达量较低且差异不显著；且软面团期的‘涅如姆扎’籽粒HvnANT1基因的表达量极显著高于‘昆仑10号’（P<0.01）。花青素合成相关的结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR与该基因表达量模式相似。综上，青稞HvnANT1蛋白结构中的SANT结构域在物种进化过程中比较保守；该基因定位在细胞核内，符合转录因子特性；HvnANT1基因表达模式与结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR相似，在籽粒颜色形成的软面团期表达量极显著升高。