【目的】从番茄中克隆高效转录的SlU6启动子,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,并在番茄中建立CRISPR/Cas9系统,为番茄功能基因组学和分子育种研究提供技术基础。【方法】采用PCR方法从‘中蔬四号’番茄品种中克隆4种SlU6启动子,利用Transfer PCR方法分别对4个启动子进行两种不同长度的截短,分别构建8个截短的SlU6启动子驱动GUS的植物融合表达载体。利用农杆菌瞬时转化法分别转染番茄叶片,通过GUS染色筛选出在番茄叶片中转录活性较高的SlU6-2启动子。采用DNA重组技术构建以Sl

【目的】U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件,其可能存在物种特异性因子,且长度不同转录活性存在差异。迄今在苹果(Malus×domestica)上对U6启动子尚缺乏研究。因此,筛选出转录活性高且片段大小合适的苹果U6启动子,可以优化苹果CRISPR/Cas9基因编辑体系。【方法】利用软件DNAMAN以及启动子元件在线分析网站PLACE和plant CARE对苹果U6启动子进行比对分析;克隆并构建U6启动子驱动萤火虫荧光素酶基因(Firefly luciferase,LUC)的融合表达载体,利用农杆菌介导的瞬时转化法分别转染苹果愈伤组织和本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片;通过检测荧光素酶活性对各U6启动子进行转录活性比较。【结果】苹果基因组中共检索到6条U6 snRNA(E-value

从中蔬四号番茄品种中克隆能在番茄叶片中高效转录的SlU3启动子,为今后利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行分子育种奠定了基础。采用2轮PCR的方法,第1轮PCR从中蔬四号番茄品种中克隆了3种SlU3启动子,再采用Transfer PCR方法分别对3个启动子进行截短,共得到6个不同长度的启动子,并分别构建6个截短的SlU3启动子驱动GUS融合植物表达载体,利用农杆菌转化法分别转染番茄叶片。运用DNAMAN软件对已克隆的SlU3和拟南芥AtU3启动子序列具有转录功能的必要元件进行序列分析;经过2轮PCR,首先从中蔬四号番茄品种中克隆了3种SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P启动子,其长度分别是1 156,1 114,1 147 bp,再采用Transfer PCR方法分别对3个启动子进行截短,共得到6个不同长度的启动子,其长度依次是489,318,450,248,457,248 bp,并分别构建6个截短SlU3启动子驱动GUS融合植物表达载体,启动子序列比对分析发现,番茄U3启动子与拟南芥U3启动子一样,也含有比较保守的2个元件,USE和TATA框,2个元件之间的位置比较固定。利用农杆菌转化法分别转染番茄叶片,结果显示,成功侵染后的番茄叶片均被染成蓝色,表明已克隆的6种不同截短番茄SlU3启动子均具有转录活性。成功克隆了6种在番茄叶片中高效转录的SlU3启动子,为构建番茄CRISPR/Cas9基因编辑载体提供更多高效的内源启动子。

【目的】以棉花品种新海16基因组DNA为模板,克隆海岛棉(Gossypium barbadense L.)Gb U6启动子,筛选出能在棉花生殖细胞中(花粉)高效转录的Gb U6启动子,为利用基因组编辑技术进行棉花分子育种奠定重要基础。【方法】采用两轮PCR方法克隆完整的Gb U6启动子。根据网上公布的棉花基因组数据库序列,利用Primer5.0软件设计5对引物,进行第一轮能覆盖完整Gb U6启动子的PCR扩增,产物克隆测序正确后,再利用transfer PCR法将Gb U6启动子精确亚克隆到CRISPR/Cas9基因组编辑载体中;第二轮扩增产物测序正确后,运用DNAMAN软件对克隆成功的5个G...

【背景】U6启动子是CRISPR/Cas9基因编辑系统中驱动sgRNA转录的重要元件，而不同物种的U6启动子转录活性可能存在差异，且物种内源U6启动子相比物种外源U6启动子可能具有更高效的启动效率。迄今对蔷薇属（Rosa）植物的U6启动子少有报道，且尚未获得转录活性强于拟南芥U6的启动子。【目的】筛选转录活性更高的蔷薇属植物U6启动子，为后续月季和野蔷薇等蔷薇属植物CRISPR/Cas9基因编辑系统的优化和分子育种奠定基础。【方法】利用拟南芥保守的102 bp U6 snRNA序列，从中国古老月季‘月月粉’（Rosa chinensis Old Blush,OB）基因组中克隆相似性最高的6个OBU6启动子，从野蔷薇（R. multiflora）基因组中克隆相似性最高的7个RmU6启动子，并构建OBU6启动子和RmU6启动子分别驱动LUC和GUS报告基因的融合表达载体，利用农杆菌介导的瞬时转化法转染本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片和月季‘萨曼莎’（R. Samantha）组培苗，通过双荧光素酶活性检测和GUS组织化学染色对月季和野蔷薇的启动子转录活性分别进行比较。【结果】‘月月粉’6个OBU6启动子和野蔷薇7个RmU6启动子均具有影响U6启动子转录活性的两个必要元件USE和TATA box。双荧光素酶活性检测和GUS组织化学染色结果显示，月季‘月月粉’OBU6启动子和野蔷薇RmU6启动子均具有转录活性，但OBU6启动子的转录活性均弱于拟南芥AtU6-1启动子。考虑到过长的U6启动子可能会削弱其转录活性，于是选取其中转录活性相对较高的OBU6-4进行5′端截短（1 507、1 076、574和187 bp），但截短后的启动子未能提高转录活性；而在野蔷薇中，成功筛选到一个长度为630 bp的RmU6-2启动子，其转录活性显著高于拟南芥AtU6-1启动子。【结论】从月季‘月月粉’中克隆得到6条U6启动子，从野蔷薇中克隆得到7条U6启动子，并筛选出一条转录活性显著高于拟南芥AtU6-1启动子的野蔷薇U6启动子RmU6-2，为构建蔷薇属植物CRISPR/Cas9基因组编辑系统提供了极具应用潜力的启动子。

【目的】分离用于禽源细胞中表达短干扰RNA(short interference RNA,siRNA)的禽U6启动子。【方法】以鸡基因组为模板进行PCR扩增,将扩增产物进行序列测定和生物信息学分析,并将其插入报告基因载体pEGFP-N1中,获得siRNA表达载体pGFP-U6,将由软件预测针对GFP基因的siRNA所对应的shRNA(short hairpin RNA)插入其中,获得pGFP-U6-shRNA;以含人H1启动子的siRNA表达载体pGFP-H1-shRNA为对照,分别转染COS-1和DF-1细胞,用荧光显微镜和流式细胞仪测定转染细胞培养中GFP阳性细胞数和荧光总量。【结果】克隆...

为研究番茄ARF2基因表达模式及其调控番茄器官发育的分子机理,利用PCR技术扩增了SlARF2转录起始点上游2462bp的片段,利用农杆菌转化获得SlARF2∶∶GUS融合基因的番茄转基因植株。启动子序列分析表明,该启动子片段含有MeJA、ETH、GA和SA等激素相应的顺式作用元件。GUS染色结果表明,ARF2在生长点、幼叶基部、主茎的表皮毛中表达强烈。暗示SlARF2可能参与调控这些器官的发育过程。

目的克隆获得番茄根特异表达启动子,为利用基因工程技术创制番茄新种质奠定基础。方法利用Clontech公司的基因组步移(genome walking)技术,扩增番茄根特异表达基因LeGRP2的上游调控序列,并构建植物表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥,以GUS为报告基因研究该调控序列的组织表达特异性。结果以番茄基因组DNA为模板,经过2次基因组步移,获得了LeGRP2基因上游1959bp的调控序列(GenBank登录号:EU262719),分析发现含有9个与根特异表达相关的顺式作用元件ROOTMOTIFTAPOX1。转基因拟南芥的组织化学染色分析表明,GUS基因主要在拟南芥的根部特异表达。结论...

为探明miRNA在红麻中的功能,以红麻基因组DNA为模板,根据红麻microRNA(miRNA)高通量测序数据结果,克隆红麻miR394前体基因序列,并构建CRISPR/Cas9载体。结果表明红麻miR394前体基因序列大小为175bp,用Mfold在线软件分析,其前体序列能形成稳定的二级结构。根据红麻miR394前体基因序列,设计合适的CRISPR/Cas9靶标序列,利用改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,以AtU3b和AtU6-29质粒为模板,使用Overlapping PCR法构建AtU3b-sgRNA和AtU6-29-sgRNA表达盒,使用Golden Gate Cloning方法成功把靶标AtU3b-sgRNA和AtU6-29-sgRNA表达盒构建到pYLCRISPR/Cas9载体中,并将构建好的载体命名为pCas9-miR394。分离红麻叶片原生质体,将pCas9-miR394载体转入红麻叶片原生质体中进行瞬时表达,测序结果表明:2个靶点Target site 1(T1)和Target site 2(T2)处都发生碱基突变,表明pCas9-miR394载体在红麻原生质体中具有靶向切割的活性。

以欧亚种无核葡萄品种‘无核白鸡心’(Vitisvinifera L.cv.Centennial Seedless)为材料,通过半定量RTPCR比较了VvSCL9基因在葡萄不同组织器官中的表达,利用转录组分析探索了葡萄果实中VvSCL9对外源赤霉素(GA3)处理的响应。通过全基因序列和启动子克隆、启动子生物信息学分析及转基因验证进一步研究了VvSCL9的表达特征及对不同胁迫的响应。结果表明,VvSCL9在葡萄梢尖、幼叶、成叶、老叶和花序等组织器官中均有表达,参与葡萄果实第一快速生长期的发育,但对外源GA3处理无显著响应。对克隆得到的VvSCL9启动子进行生物信息学分析,发现多个激素和逆境胁迫响应...

以欧亚种无核葡萄品种‘无核白鸡心’（ＶｉｔｉｓＶｉｎｉｆｅｒａ Ｌ．ｃＶ．ｃｅｎｔｅｎｎｉａＬ ｓｅｅｄＬｅｓｓ）为材料，通过半定量ｒｔＰｃｒ比较了ＶＶｓｃＬ９基因在葡萄不同组织器官中的表达，利用转录组分析探索了葡萄果实中ＶＶｓｃＬ９对外源赤霉素（Ｇａ３）处理的响应。通过全基因序列和启动子克隆、启动子生物信息学分析及转基因验证进一步研究了ＶＶｓｃＬ９的表达特征及对不同胁迫的响应。结果表明，ＶＶｓｃＬ９在葡萄梢尖、幼叶、成叶、老叶和花序等组织器官中均有表达，参与葡萄果实第一快速生长期的发育，但对外源Ｇａ３处理无显著响应。对克隆得到的ＶＶｓｃＬ９启动子进行生物信息学分析，发现多个激素和逆境胁迫响应．．．

【目的】SPL是植物特有的转录因子，参与植物幼年期向成年期的转变、营养生长向生殖生长的转变、花发育、孢子发生、叶片和根发育、逆境响应等多个过程，在植物的生长发育过程中起着非常重要的作用。探究白桦中BpSPL6基因启动子区的顺式作用元件，以及该启动子在正常和胁迫条件下的表达模式，可为进一步研究BpSPL6基因的功能提供参考，也可为了解白桦的抗逆机制提供依据。【方法】以本实验室组培白桦的总DNA为模板，经PCR克隆了BpSPL6基因上游1 703 bp的启动子序列，用PLACE和Plant CARE在线软件分析启动子区的顺式作用元件。构建了BpSPL6基因启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体并转化拟南芥，探究其组织表达特性和胁迫条件下的表达模式。【结果】PCR成功克隆了BpSPL6基因上游1 703 bp的启动子序列，对启动子区的顺式作用元件预测发现除了含有核心启动元件TATA-box、CAAT-box外，还包括2种特异组织表达元件（根、花粉），10种激素响应元件（生长素、赤霉素、水杨酸、脱落酸），4种脱水响应元件等。对转基因拟南芥进行GUS染色结果表明，BpSPL6基因启动子驱动的GUS基因在转基因拟南芥中的表达具有时空特异性。在拟南芥的整个发育过程中，BpSPL6基因启动子驱动GUS基因在真叶叶片中表达，但是表达部位不同。随着叶片的生长，首先在叶片的顶端表达，随后扩展到叶片的叶脉并直至整个叶片，并且表达量逐渐升高。同时BpSPL6基因启动子驱动的GUS基因在拟南芥营养生长时期的根部都有表达。并且经氯化钠和甘露醇胁迫后其表达量降低。对比两种胁迫，受到氯化钠胁迫后GUS基因的表达量变化更大，说明对氯化钠胁迫的响应更加强烈。【结论】BpSPL6基因可能参与了植物的叶片、根发育以及对盐和干旱胁迫的响应。

根据海带配子体光捕获蛋白基因lhcf6的cDNA全长序列(GenBank登录号:DQ250739)设计引物,利用基因组步移技术克隆得到其在雌、雄配子体中的5'-侧翼序列,长度分别为932,901 bp。测序结果比对显示二者相似度为33.3%,说明该基因在雌、雄配子体中具有不同的上游调控区。网络服务器PlantCARE和Softberry启动子元件预测结果表明,二者均含有TATA框、节律性相关元件MBS、光反应相关元件MNF1和GAG-motif,其中雌配子体lhcf6基因5'-侧翼序列还特有LHC基因特征元件AT-rich序列,雄配子体特有节律性相关元件Circadian元件,这些元件可能与该...

基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术是一种新兴的分子修饰工具,可实现基因组特定位点碱基的缺失、插入或替换,造成基因功能丧失,现已广泛应用于基因功能的研究。为深入探讨甘蓝型油菜中Bn SVP的生物学功能,以中双11号基因组(甘蓝型油菜参考基因组,v4.1)中的4个Bn SVP为靶标基因,并针对不同染色体上的Bn SVP基因,应用CRISPR-P 2.0软件共设计了12条特异sg RNA种子序列,以实现4个Bn SVP同源基因的全部或部分敲除;以p YLCRISPR-Cas9P35S-H为基本载体,以At U3b或At U3d为sg RNA转录启动子,采用Golden gate cloning技术分别组装构建了6个双靶点CRISPR/Cas9植物表达载体。测序结果表明,6个CRISPR/Cas9植物表达载体各sg RNA表达盒DNA序列正确,双靶点组装顺序无误。研究结果为进一步原生质体瞬时表达和农杆菌介导的油菜遗传转化奠定了基础,同时也为应用CRISPR/Cas9基因组编辑系统研究植物多拷贝同源基因的功能提供参考。

为明确杜梨赤霉素受体GID1(Gibberellin insensitive dwarf 1)的生物学功能,以杜梨为试材,通过同源克隆方法得到PbGID1s基因,利用生物信息学分析软件构建基因结构并设计靶位点;利用酶切-连接方法将带有靶点的sgRNA表达盒构建至CRISPR/Cas9表达载体上;通过农杆菌介导方法,将CRISPR/Cas9表达载体转化至杜梨子叶中。结果表明,在杜梨基因组中克隆得到4个PbGID1s,分别命名为PbGID1b-1、PbGID1b-2、PbGID1c-1、PbGID1c-2,基因结构分析显示该家族基因均由2个外显子和1个内含子组成;氨基酸序列比对发现PbGID1s均具有GID1家族所特有的HGG和GXSXG保守结构域;将含有5个靶位点的sgRNA表达盒成功构建至pYLCRISPR/Cas9P_(35S)-N植物表达载体上,可同时对该家族4个基因进行编辑;杜梨遗传转化试验结果表明,共计浸染595粒杜梨子叶,获得抗性芽176个,阳性植株33株,转化效率达到5.55%。成功构建了可以同时靶向杜梨PbGID1s家族基因的CRISPR/Cas9载体,通过农杆菌介导,成功将该载体转化至杜梨子叶,并获得阳性植株,为杜梨遗传转化和基因编辑创建矮生突变体研究提供了重要参考。