利用绿色荧光蛋白基因 gfp标记研究了土壤中Cu2 + 胁迫对饭豆 (VignaumbellateL .)根瘤菌JMC14 0 2G腐生存活和共生固氮能力的影响。研究结果表明 :在液体培养条件下 ,向培养基加入 1μg/mL的Cu2 + 时 ,JMC14 0 2G的生长受到轻微抑制 ;当Cu2 + 浓度达到 5 μg/mL和 7μg/mL时 ,JMC14 0 2G的生长受到严重抑制 ;当Cu2 + 浓度达到 10 μg/mL时 ,JMC14 0 2G已不能生长。在灭菌土壤中Cu2 + 添加量小于 2 0 0mg/kg时 ,JMC14 0 2G数量在 37d内能保持在 1.74× 10 5cfu...

从湖北省洪湖市土壤中分离纯化了９２株快生型大豆根瘤菌。用来自８个取样地点的１２个快生型典型菌株和１个慢生型菌株的抗血清检测了该快生型大豆根瘤菌群体的抗原构成。其中６５株菌归入１５个血清型，２０．７％属于ＵＳＤＡ２０５型，１５．２％为Ａｄ３０１（１）型。有２７株不与已知抗血清反应，为未知的血清型。对供试菌株质粒进行的快速检测结果表明，各菌株均含有２～６个质粒，其中最大的质粒在５００Ｍｄ左右。含４个质粒的菌株最多，含５～６个质粒的菌株较少。根据质粒图谱分析，洪湖快生型大豆根瘤菌可分为１１个质粒型．菌株的质粒型与血清型之间无明显相关性。

【目的】大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）是微生物肥料重要的功能菌种之一，可通过生物固氮为大豆生长提供氮素，实现节本增效，菌株5873作为其典型代表，已广泛应用于农业生产。筛选并鉴定其特异引物，建立大豆根瘤菌5873菌株水平的快速检测方法，对微生物肥料生产菌种鉴定、产品质量检测和功能评价至关重要。【方法】以商业化菌株大豆根瘤菌5873为供试材料，基于其全基因组序列和NCBI数据库中大豆根瘤菌种内参比菌株相关序列，以及与其高度同源（基因组ANI值大于99.95%）的大豆根瘤菌USDA 6T差异片段，通过多重序列比对，进行特异引物设计和筛选，获得特异性引物对，并通过对PCR反应条件/体系优化、特异性及灵敏度检测，建立大豆根瘤菌5873的快速检测方法。然后，采用盆栽试验，将大豆根瘤菌5873与其他根瘤菌菌株混合接种于大豆根际，应用上述方法对大豆根瘤菌5873竞争结瘤能力进行评价和方法验证。【结果】筛选获得了一组特异引物4-4和Q1(4-4-F 5′-GATAAGGCCACGGGTGAACA-3′/4-4-R 5′-CACTCGATAAGCTCCGCTGT-3′和Q1-F 5′-CCGGTCGTGACTGGAATGAT-3′/Q1-R 5′-TCGAGGCCTACAAGAACGTC-3′)，优化并建立了PCR快速检测方法，即反应体系：Premix Taq~(TM) 12.5μL，引物各1.0μL，基因组DNA 15 ng左右，加ddH2O补足至25μL；反应条件：95℃预热5 min,94℃变性45 s,61℃退火45 s,72℃延伸60 s,30个循环，再72℃延伸10 min。通过凝胶电泳检测目的条带的有无（355和218 bp），即可实现大豆根瘤菌5873的快速检测，该方法检出灵敏度为1 850 CFU/μL。此外，借助该方法可以成功地评价大豆根瘤菌5873竞争结瘤能力，与传统BOX-PCR评价结果一致。【结论】大豆根瘤菌5873快速鉴定方法的建立实现了以菌体发酵液或根瘤破碎提取液为模板，直接进行PCR扩增的鉴定操作，省去了根瘤的分离、根瘤菌分离纯化、培养、DNA提取及测序鉴定等繁琐的环节，大大减少了工作量，只需短短几个小时便可准确检测大豆根瘤菌5873，为微生物肥料中根瘤菌菌剂的产品质量检测和竞争结瘤能力评价提供了参考。

在灭菌和未灭菌土盆栽缩影条件下 ,比较研究了重组大豆根瘤菌HN0 1DL和TA113QD在 4个不同品种大豆根圈中的定殖动态与水平 ,并初步考察了其与共生效应的关系。结果表明 :HN0 1DL在渝豆 1号和宁镇 1号大豆根圈表现出较强的适应性和竞争性 ,而TA113QD则在Williams大豆根圈的适应性较强 ,在宁镇 1号大豆根圈的适应性较差 ,且供试菌在 4种大豆根圈定殖动态与水平的差异在共生效应上也有一定程度的反映 ,但未达到显著水平

生长在氮素含量分别为０、７５、１５０、３００和６００ｍｇ／钵下的盆栽大豆，其植株叶片的叶绿素含量与植株干重（ｒ＝０．９３，Ｐ＜０．０１）、植株全氮量（ｒ＝０．８７，Ｐ＜０．０１）显著相关。在与之平行的试验中，当共生有效性不同的快生型大豆根瘤菌分别接种于栽培大豆后，植株叶片的叶绿素含量与植株干重（ｒ＝０．９８，Ｐ＜０．０１）、植株全氮量（ｒ＝０．８９，Ｐ＜０．０１）和根瘤的固氮酶活性（ｒ＝０．９５，Ｐ＜０．０１）也存在显著的相关性。利用叶绿素含量对供试快生型大豆根瘤菌共生有效性进行评估的结果与用植株全氮量的结果相似。研究证明可以用叶绿素含量来间接指示大豆植株的含氮量及根瘤菌的共生有效性。

采用质粒快速检测法从供试33株费氏中华根瘤菌中分别检测出2~4个内源大质粒。用根据豌豆根瘤菌的repC基因设计1对引物RC1和RC3,从供试菌株及3株华癸中生根瘤菌和1株大豆慢生根瘤菌中扩增得到repC基因片段,证明在费氏中华根瘤菌中广泛存在repC基因。通过对扩增产物的测序,并与已报道的repC基因序列进行聚类分析,发现供试菌株可分为2个群,群a和群b,群内十分保守,但群间差异明显;其中群b的序列与已知类型的差异明显。

通过三亲本杂交,分别将紫云英根瘤菌7635R的基因文库和慢生型大豆根瘤菌22-10的基因文库引入到慢生型大豆根瘤菌22-10中,获得了大量的含有外源DNA片段的转移接合子。以结瘤试验作选择标准,从中筛选到3株具有较高固氮效率的基因工程菌株HN5-1、HN5-2和HN22-2。采用反向杂交,将接合子HN5-2中的外源重组质粒转回到大肠杆菌中,提取质粒作EcoRI酶切。表明pLAFR1质粒载体上携带有大约20 kb大小的DNA片段。实验还证明,在含有从根瘤菌转移而来的pLAFR1质粒的大肠杆菌细胞中,常伴随有辅助性质粒pRK2013的存在,用四环素和卡那霉素两种选择性抗性可淘汰其中的pRK2013...

以在我国黑龙江地区广泛应用的慢生型大豆根瘤菌22—10为出发菌株,通过导入克隆有快生型大豆根瘤菌菌株B52的DNA片段的重组质粒pBj32H_2,构建了高效固氮大豆基因工程根瘤菌32.该菌株在黑龙江地区进行田间中试和大面积(15万亩)推广应用,获得比出发菌株22—10增产大豆7.4%和8.5%的效果。为了研究pBj32H_2中所克隆基因的结构和功能,本工作对pBj32H_2进行了限制性内切酶图谱分析,确定了pBj32H_2中外源DNA片段的大小及EcoRⅠ、BglⅡ、XhoⅠ的酶切位点,建立了该片段的物理图谱。

采用基因敲除构建豌豆根瘤菌ｏｈｒ Ｂ基因突变株，研究突变株的抗氧化和共生固氮表型。结果表明：ｏｈｒ Ｂ基因不影响菌株在自生培养条件下的生长能力，但对氢过氧化枯烯（ｃｕｍｅｎｅ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｙｄｅ，ｃｕ ｏｏｈ）、过氧化氢（ｈ２ｏ２）、次氯酸钠（ｎａ ｃｌ ｏ）等氧化物敏感，且在ｃｕ ｏｏｈ胁迫下，相比野生型菌株，突变株的存活率显著下降。荧光定量ｒＴ－ｐｃｒ结果显示，豌豆根瘤菌ｏｈｒ Ｂ基因表达不受ｈ２ｏ２诱导，且ｏｈｒ Ｂ基因的缺失对其他抗氧化基因的表达没有影响。共生实验表明，ｏｈｒ Ｂ基因对根瘤菌共生固氮能力及根际定殖能力没有影响，但在７ ｄ瘤龄的豌豆根瘤类菌体中表达水平显著提高，并．．．

【背景】花生(Arachis hypogaea L.)是世界上重要的油料和经济作物。在我国南方产区,大部分花生种植地土壤为酸性。酸性土壤不仅pH值低、瘦瘠,而且还有低磷、铝毒等诸多障碍因素,严重限制了花生的生物固氮及产量。【目的】本文旨在分离及应用适应酸性土壤的高效固氮根瘤菌,提高花生固氮效率及产量,改良酸性土壤。【方法】利用平板划线结合镜检的方法,从田间采集的新鲜花生根瘤中分离纯化单菌落;通过PCR技术检测分离物中是否含有结瘤基因nodA和固氮基因nifH,进行根瘤菌的初步分子鉴定;再通过16S rRNA基因序列比对,对根瘤菌进行进一步分子鉴定。候选根瘤菌通过水培回接,检测其与花生的共生结瘤及固氮能力;再通过田间试验评价筛选出来的候选根瘤菌在酸性土壤上的应用效果。【结果】本研究首先从不同酸性土壤种植区域的花生根瘤中分离、纯化得到256个分离物;其中10株含有nodA和nifH,初步确定为根瘤菌。经16S rRNA基因全长序列测定,发现8株为慢生型根瘤菌(Bradyrhizobium),2株为根瘤菌属根瘤菌(Rhizobium)。水培回接试验发现,这10株根瘤菌均能够与花生共生、形成有效根瘤,证实是花生根瘤菌。在此基础上,选取4株固氮效率较高的根瘤菌,在酸性土壤上应用。结果表明,4株根瘤菌均能与花生在酸性土壤上形成根瘤,而未接种的花生根部不能形成根瘤。并且接种根瘤菌后显著改善了花生氮营养,提高了花生的生物量和产量。与不接种的对照相比,接种根瘤菌后,花生生物量、产量和氮含量分别提高了27.1%—38.0%、24.7%—104.2%和73.9%—151.3%。【结论】本研究分离鉴定的花生根瘤菌能够高效固氮和适应酸性土壤,具有重要的应用前景。

根据已公布的大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)nolA基因序列(AF322013),设计了一对保守区的特异性引物和1对非保守区的全长基因引物,通过PCR扩增发现在个别费氏中华根瘤菌(Sinorhi zobium fredii)中也存在nolA基因。进一步的结瘤抑制试验结果表明:含有nolA基因的费氏中华根瘤菌也有种群密度依赖调节方式的结瘤抑制现象,本结果对提高商品化根瘤菌剂的竞争结瘤能力具有重要的参考价值。

【目的】分析根瘤菌基因组中的简单重复序列(simple sequence repeats,SSRs),为其在根瘤菌遗传多样性研究中的应用提供有益的信息。【方法】利用公共的微生物串联重复序列数据库资源,对已测序的3种根瘤菌基因组中SSRs的结构类型、分布、丰度等进行系统的比较分析。【结果】大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)基因组中的SSRs分别为1410个、859个和638个,3种根瘤菌基因组中长重复的四、五、六核苷酸基序更为丰富,变异性更高。数目...

在构建M.huakuii tpp基因突变株的基础上,通过自生生长和植物盆栽试验,研究焦磷酸硫胺素结合蛋白tpp基因在根瘤菌的生长及与紫云英宿主共生固氮过程中的功能。通过同源重组获得华癸中慢生根瘤菌tpp突变菌株HKtpp,并进一步研究tpp基因突变对菌株生长及共生固氮功能的影响。结果显示:tpp基因突变会减缓菌株生长,突变菌株胞内的谷胱甘肽还原酶活性显著降低。植物盆栽试验表明,突变菌株感染紫云英宿主形成有效的红色根瘤,但是其固氮酶活降低了26.4%。结果表明:tpp基因在根瘤菌的生长和共生固氮中发挥着重要作用。