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[期刊] 水产学报
[作者]
李岩 庞欢瑛 鲁义善 吴灶和 简纪常
用免疫蛋白质组学的研究方法鉴定了哈氏弧菌的免疫反应蛋白。将哈氏弧菌接种于TSB培养基28℃培养18h,利用裂解液裂解细菌,提取全菌可溶性蛋白,一向电泳采用7cmpH4～7的胶条进行等电聚焦,二向用12.5%的SDS-PAGE胶分离蛋白质,考马斯亮蓝染色,获得双向电泳图谱,再结合免疫转印技术检测免疫反应的蛋白质,利用ImageMaster 2D Platinum进行配对分析得到15个非特异性的免疫反应性蛋白点,30个特异性的免疫反应性蛋白点。经过鉴定得到13种非特异性的免疫反应性蛋白质,这其中有2对蛋白在胶上的位置不同,但鉴定为同一种蛋白;同时得到28种特异性的免疫反应性蛋白质,有一个蛋白点没有...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
陈凡若 张嘉俊 鹿萍 崔宁 崔莹莹 崔子寅 党光辉 刘思国
【背景】副结核病（paratuberculosis,PTB）是由副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis,MAP）主要引起反刍动物的一种慢性消耗性传染病。患病动物表现为肉芽肿性肠炎和肠道的功能失调、顽固性腹泻、渐进性消瘦、营养不良、贫血、嗜睡甚至死亡。PTB给畜牧业造成巨大的经济损失，并且严重威胁公共卫生安全。由于目前临床上对于PTB的检测和控制手段不够完善，现有的PTB疫苗保护效果不佳，并且干扰牛结核病的诊断，因此亟需研发免疫原性强、保护效果佳的疫苗以用于PTB的防控。【目的】通过筛选MAP免疫原蛋白，并对其免疫保护效果进行评价，为PTB的防控提供数据支持。【方法】根据MAP的p22、map1272c、map3531c、map3783、map3701c以及map3527这6个基因，分别构建5种重组质粒，在获得5种重组蛋白基础上，联合MONTANIDE ISA 61 VG佐剂皮下多点注射免疫小鼠，通过IFN-γ ELISPOT试验筛选出最佳免疫原；随后将最佳免疫原和已报道的66NC融合蛋白混合，经皮下多点注射免疫小鼠，在二免3周后用1×10~8 CFU的MAP K-10菌株腹腔感染小鼠。通过IFN-γ ELISPOT试验，抗体监测和细胞因子检测，分析感染后小鼠的体重、肝脏病理学和组织病理学变化及其荷菌数差异，综合评价候选亚单位疫苗的免疫原性和免疫保护效果。【结果】以MAP p22、map1272c、map3531c、map3783以及map3701c为基础成功构建和表达了5种融合蛋白58F、62F、69F、46F和52F，其中免疫58F后产生的IFN-γ水平最高，是更具潜力的候选免疫原，且以融合蛋白组合66NC+58F诱导持久高滴度的IgG、IgM、IgG1和IgG2a水平，诱导特异性的IFN-γ、TNF-α和IL-17A的释放；在保护效果评价中，融合蛋白组合66NC+58F抵抗MAP感染造成的体重下降，显著减轻肝脏的病理损伤，降低MAP在肝脏中的定植。【结论】融合蛋白组合66NC+58F诱导小鼠产生Th1和Th17型免疫反应，对MAP感染有着一定免疫保护作用，是PTB重要的候选亚单位疫苗。
[期刊] 水产学报
[作者]
黄浦江 黄郁葱 简纪常 吴灶和 鲁义善 张雪利
参照GenBank上登录的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因序列,设计引物扩增OmpW的开放阅读框,序列分析结果显示该基因全长645 bp。将其定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌BL21中成功表达出带His-tag的融合蛋白,融合蛋白分子量约为43.8 ku,且主要以包涵体形式存在。优化的表达条件为37℃,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导时间5 h。将纯化的融合蛋白免疫SPF昆明小鼠制备多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价达1∶30 000,Western-blot结果表明鼠抗OmpW血清能与诱导后的重组蛋白发生特异反应,提示OmpW可能是哈维氏弧菌的一种重要保护性抗原...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
黄辉 毛芝娟 陈吉刚
根据已发表的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)外膜蛋白OmpU的基因序列设计1对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,自哈维氏弧菌致病菌株基因组中扩增获得一段约1 000 bp的序列,构建重组载体pMD18-T-OmpU;测序结果表明,该基因与已发表的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU序列存在98%以上的相似性,该序列在GenBank上的登录号为FJ919231。构建表达质粒pET-30a(+)-OmpU后转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3),在IPTG诱导下实现高效表达,SDS-PAGE显示重组蛋白分子质量约为41 ku,与预期基本相符。重组蛋白以包涵体形式表达。以脲素法得到...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
郝贵杰 沈锦玉 潘晓艺 尹文林 曹铮
胞外蛋白酶(ECPase)是哈维氏弧菌GYC1108-1胞外产物的主要致病因子,经鉴定其为半胱氨酸蛋白酶,分子量约55kD,能够分解脱脂奶中的酪蛋白,命名为1108-ECPase。本实验建立了胞外蛋白酶活性平板法检测1108-ECPase和YZ-ECPase的相对酶活(YZ为由本实验室构建的能够分泌目的蛋白酶的重组菌),并利用这个方法确定了细菌分泌ECPase达最高峰的培养时间为36h,粗提ECPase最适的饱和硫酸铵浓度为70%。GYC1108-1和YZ培养上清经硫酸铵盐析,SephadexG-25凝胶过柱后,得到较为纯化的1108-ECPase和YZ-ECPase。选择白油、蜂胶和弗氏3种...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
陆吉虎 李槿年 岑俊宇 李世东 李冠青
采用PCR方法从鱼源霍乱弧菌Y1株(Vibrio cholerae Y1)扩增毒素共调菌毛蛋白A(toxin-coregulated pilin A,TcpA)基因并克隆至pMD18-T载体。序列分析显示tcpA基因ORF长675 bp,编码224个氨基酸(GenBank登录号EU649677)。同源性比对发现,该基因与GenBank中登录的7个霍乱弧菌参考株相应基因序列的核苷酸同源性和氨基酸同源性均很高,分别为99.6%～99.7%和98.7%～99.1%,表明TcpA蛋白相当保守。将tcpA基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,并进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现分子量约为4...
[期刊] 水产学报
[作者]
黄志坚 何建国
利用初步制备的溶藻弧菌外膜蛋白(outer membrane protein ofVibrio alginolyticus,Va-OMP)、溶藻弧菌蛋白分子量58kD外膜蛋白(Va-OMP58)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus,Va)灭活菌苗、溶藻弧菌脂多糖(lipopolysaccharides ofVibrio alginolyticus,Va-LPS)菌苗等进行主动保护性和被动保护性的实验比较,Va-OMP、Va-OMP58免疫组小鼠免疫后用活菌攻击,免疫保护率为62.5%~86.7%,而Va-LPS组和Va灭活菌苗组的免疫保护率为50%~62.5%,对照组的免疫保护...
关键词：
溶藻弧菌 外膜蛋白 免疫原性 免疫保护性
[期刊] 中国水产科学
[作者]
李华 石存斌 钱永华 潘厚军 吴淑勤
采用十二烷基肌氨酸钠法提取哈氏弧菌(Vibrio harveyi)SpGY020601株的外膜蛋白(OMPC),采用酚水法提取溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)EpGS021001株的脂多糖(LPS)。通过碳化二亚铵(EDC)介导的缩合反应,将哈氏弧菌的OMPC与溶藻弧菌的LPS偶联。OMPC-LPS偶联物、未偶联的哈氏弧菌OMPC、溶藻弧菌LPS、哈氏弧菌OMPC和溶藻弧菌LPS的简单混合物以及生理盐水按相同程序免疫卵形鲳(Trachinotus cvatus)。检测血清溶菌酶活性、血清抗体微量凝集反应结果显示,卵型鲳经OMPC-LPS偶联物、OMPC、LPS以及二者的简单...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
余萍 董超 姚春馨 丁玉梅 周晓罡
【目的】探讨氮源是否影响马铃薯晚疫病菌分泌蛋白的致病性。【方法】应用蛋白质组学Label-free技术,对受氮饥饿处理24 h和未处理的马铃薯晚疫病菌分泌蛋白进行鉴定,并对其鉴定蛋白进行生物信息学分析。【结果】共发现61个蛋白质的表达量存在显著差异,其中41个蛋白质表达量上调,20个蛋白质表达量下调。经生物信息学分析表明它们95%定位于细胞核、细胞质、线粒体和分泌型,主要参与碳代谢、氨基酸的生物合成和核糖体代谢,参与的生物过程主要是细胞过程、代谢过程和细胞成分组织或生物起源。【结论】氮源提高致病性蛋白的分泌,影响马铃薯晚疫病菌的致病性。
[期刊] 华北农学报
[作者]
袁廷杰 王加启 杨永新 卜登攀 章玉涛 赵圣国 周凌云 李发弟
为探讨脲酶B(Ure B)亚单位疫苗免疫后奶牛血清蛋白质组分的表达变化。选用8头健康的泌乳荷斯坦奶牛,分为免疫处理组和空白对照组,分别于胯部两侧肌肉注射Ure B亚单位疫苗(含抗原蛋白0.2 mg)和生理盐水,每隔2周进行加强免疫,并于免疫后第56天采集奶牛血样,用间接ELISA法测定血清中特异性IgG、IgM和IgA效价,用二维凝胶电泳(2-DE)结合MALDI-TOF-TOF质谱技术研究血清蛋白质组表达变化。免疫处理组奶牛血清中特异性IgG效价显著高于对照组(P0.05)。血清蛋白质组分析发现6个差异表达蛋白...
关键词：
脲酶B亚单位疫苗 奶牛 血清 蛋白质组
[期刊] 中国水产科学
[作者]
郑磊 郭养浩 马振宁 樊海平 吴斌 唐凤翔
采用延伸PCR技术拼接副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus VpATCC17802)的外膜蛋白K基因ompK和鞭毛蛋白A基因flaA,获得融合基因flaA-ompK。制备高纯度的r-OmpK,r-FlaA及r-FlaA-OmpK蛋白。分别以所制备的OmpK、FlaA-OmpK和混合蛋白OmpK+FlaA作为免疫原,通过口服及注射的方法免疫黑石斑鱼(Centropristisstriata),研究其免疫原性及对野生副溶血弧菌(Vp89)感染的免疫保护作用。ELISA分析结果表明,注射FlaA-OmpK组抗体效价最高,是OmpK组的2倍,是混合蛋白组的4倍,注射FlaA-Om...
[期刊] 水产学报
[作者]
梁海鹰 陈永新 简纪常 吴灶和
为研究溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护作用,实验构建了重组真核表达质粒pcDNA-flaC并将该质粒肌肉注射红笛鲷,采用PCR、RT-PCR、ELISA和攻毒试验等方法检测了该真核表达质粒在红笛鲷组织内的分布、表达和对红笛鲷的免疫保护。PCR结果显示,免疫接种7和28 d,注射点周围肌肉、鳃、肾脏、肝脏和脾脏都存在质粒分布;RT-PCR结果显示,免疫接种后第7天、14天和28天,红笛鲷不同组织内均有目的基因表达。ELISA结果表明,鱼血清内产生了抗FlaC蛋白的抗体,表明DNA疫苗免疫后鱼体表达了目的蛋白,并诱导产生了相应抗体。攻毒实验表明,免疫后的红笛鲷能较好地抵抗致...
关键词：
红笛鲷 溶藻弧菌 DNA疫苗 免疫保护率
[期刊] 中国水产科学
[作者]
莫照兰 李会荣 俞勇 王祥红 纪伟尚 徐怀恕 P.S. Sudheesh
实验检测了气味黄杆菌的胞外糖蛋白对克氏原螯虾（Ｐｒｏｃａｍｂａｒｕｓ ｃｌａｒｋｉｉ）的几种非特异性免疫困子一凝集素、酚氧化酶、溶菌、抗菌和超氧化物歧化酶等活力的影响。注射１０ ｍｇ糖蛋白后，实验组螯虾血清的免疫因子活力均高于对照组，凝集素活力在第１～４天最高；酚氧化酶在第１～５天维持较高活力，最大活力在第 ２天，溶菌、抗菌活力在第 １～ ６天维持较高水平，分别在第 ３天、第 ２天达到最大。与对照组相比，实验组螯虾肌肉的溶菌和抗菌、超氧化物歧化酶活力没有明显的变化。结果表明：气味黄杆菌的胞外糖蛋白可增强螯虾血淋巴的凝集素、酚氧化酶、溶菌和抗菌活力。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
陈昌福 曾妍雄 楠田理一
从培养不同时间后的柱状嗜纤维菌中提取菌体脂多糖 (LPS) ,测定了其中蛋白质含量及成分的变化 ,并分别作为免疫原接种翘嘴鳜对其免疫原性进行了比较。结果表明 ,培养时间对菌体LPS中蛋白质含量没有明显影响 ,对其蛋白质成分则有一定影响 ,而菌体LPS中蛋白质成分与其免疫原性有关 ,从培养 36h的菌体中提取的菌体LPS的免疫原性最强
关键词：
柱状嗜纤维菌 脂多糖 翘嘴鳜 免疫原性
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