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[期刊] 华北农学报
[作者]
万发春 刘晓牧 宋恩亮 刘桂芬 刘振山 谭秀文
本研究首先利用组织块培养法成功分离培养了蒙山牛耳皮肤成纤维细胞,接着对培养的细胞进行了传代培养和冷冻保存及复苏检测,然后对细胞进行了形态观察和生长曲线测定,最后分别对不同汇合程度和不同保存时间细胞的核型正常率和细胞周期进行分析。结果表明,培养的细胞具有典型的成纤维细胞形态,具有正常的分裂增殖特性,没有转化倾向。在处于S期细胞数目上,60%~70%和80%~90%汇合程度组差异不显著,但显著高于90%~100%汇合程度组(P<0.05)。而在处于G0+G1期细胞数目上,60%~70%和80%~90%汇合程度组显著低于90%~100%汇合程度组(P<0.05)。冷冻保存1个月和3个月组细胞复苏率显...
关键词：
蒙山牛 成纤维细胞 染色体 细胞周期
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
赵雪萍 张寒莹 王子玉 许丹 孙永成 王锋 丁玉华
为获得适合于克隆麋鹿的供体细胞,本试验对麋鹿耳皮肤成纤维细胞的分离、培养、纯化、生长特征、核型分析和冷冻保护剂等进行了研究。通过组织块培养法获得麋鹿皮肤成纤维细胞,用胰酶轻度消化后传代3~4次可得到较纯的皮肤成纤维细胞,并经过免疫荧光鉴定;麋鹿染色体数目为2n=68,核型式为2(M)+64(A),XY(A,M);含10%NCS的DMEM培养基最适宜细胞生长;复苏后可获得87.78%的贴壁率。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
马月辉 周向梅 关伟军 李晗
将德保矮马耳缘组织经胶原酶消化法培养成原代细胞,并成功建立起该组织成纤维细胞系。这种细胞贴壁生长,具有密度接触性抑制性质;该方法获得的原代细胞经传代后接种,细胞群体倍增时间(PDT)为35.9h;细胞染色体众数2n=64的细胞数占91.3%～92.8%;乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)同工酶分析,没有其它细胞系污染;细菌、真菌、病毒、支原体检测阴性。该系符合ATCC要求的细胞系鉴定项目,成为保护矮马这一国家重要畜禽品种的宝贵遗传资源,并为相关遗传学研究提供了有效的试验材料。同时得出胶原酶消化培养法比组织块培养法在获得原代细胞速度快;组织块培养法的细胞群体倍增时间(PDT)为48h。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
潘求真 田亮 徐曙光 韩红兵 李佳 李海 孙书锋 连正兴 杨宁 李宁 谭景和
用山羊组织块和0.25%的胰蛋白酶消化培养法获得正常传代细胞,对于出现的上皮样细胞和成纤维样细胞混合生长的问题,则根据两者贴壁紧实程度不同,用0.05%的胰酶-EDTA进行不同时间的消化,将其分离纯化。纯化的成纤维体细胞经数次传代培养后,进行冷冻解冻检验表明仍具有正常的传代能力。各代体细胞的核型分析表明,在体外培养至20~30代成纤维细胞的细胞形态(为梭形细胞,高度汇合后呈火焰状)、细胞周期以及核型均为正常,符合体细胞克隆转基因的基本要求。
关键词：
山羊 成纤维细胞 体外培养
[期刊] 西南农业学报
[作者]
王献伟 王宪 梁世忠 邹知明 卢晟盛 卢克焕
为了建立广西巴马小型猪附睾成纤维细胞体外培养体系,利用微量液体组织块贴壁法原代培养分离附睾成纤维细胞,进行常规传代培养、冷冻和复苏,并通过接触抑制和解除抑制研究细胞的增殖能力,以及通过免疫荧光对其进行鉴定。结果表明,该法成功分离获得广西巴马小型猪附睾成纤维细胞,并可以大量传代和冷冻,目前已经传至55代以上,生长良好;冷冻复苏和接触抑制解除后仍可以正常培养和传代;细胞免疫荧光检测,波形蛋白表达阳性。可见,通过微量液体组织块贴壁法能成功分离得到广西巴马小型猪附睾成纤维细胞,在体外能稳定培养和传代。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
丛姗 王瑞 温建勋 郝斐 李硕 梁浩 刘东军
【目的】建立适合的牛胚胎干细胞培养环境,保持其未分化状态,保证细胞的全能性。【方法】分别培养小鼠胎儿成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)和牛胎儿成纤维细胞(bovine embryonic fibroblast,BEF),用丝裂霉素C处理两种成纤维细胞分别计数后按1﹕0、1﹕1、2﹕1、1﹕2和0﹕1的比例制成混合饲养层,观察牛胚胎干细胞的生长状态,并对生长在混合饲养层上的牛胚胎干细胞进行碱性磷酸酶,OCT4和SSEA-1免疫组化检测,OCT4、SOX2、NANOG mRNA表达RT-PCR检测、体外分化形成拟胚体等试验。【结果】①生长在混合饲养层上的牛胚...
关键词：
牛 胚胎干细胞 成纤维细胞 混合饲养层
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张艳丽 许丹 庞训胜 万永杰 王子玉 孟立 宋辉 王锋
为获得转基因克隆羊的供体细胞,本试验采用组织块培养法结合胰蛋白酶消化法分离纯化得到奶山羊胎儿成纤维细胞(gFFs),绘制了生长曲线,鉴定了胎儿细胞性别及核型特征,并且研究了脂质体量、质粒量和转染时间对gFFs的绿色荧光蛋白(GFP)转染效率的影响。结果表明:该培养体系可以支持奶山羊胎儿成纤维细胞的体外生长,其细胞形态为梭形,高度汇合后呈火焰状,增殖特性以及核型特征均为正常,性别鉴定显示该奶山羊胎儿细胞为雌性,符合体细胞转基因克隆的基本要求。24孔板中采用脂质体转染试剂4.0μL、质粒DNA 1.2μg,转染6 h可以获得最佳的转染效果,转染效率达4.21%。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
王献伟 卢晟盛 卢克焕
为建立广西巴马小型猪腹部成纤维细胞、耳成纤维细胞、睾丸成纤维细胞、肺部成纤维细胞及脾成纤维细胞体外培养体系,以新生巴马小型猪为试验材料,使用微量液体组织块贴壁法原代培养分离几种成纤维细胞,进行常规传代培养、冷冻和复苏;根据细胞的形态、生长特性等观察其体外生长能力和增殖寿命。结果显示,广西巴马小型猪腹部成纤维细胞、耳成纤维细胞、睾丸成纤维细胞、肺部成纤维细胞及脾成纤维细胞获得成功分离,体外可以传代和冷冻;冷冻复苏后仍可以正常培养和传代;腹部成纤维细胞免疫荧光检测结果显示波形蛋白表达阳性,角形蛋白表达阴性。研究成果可为显微操作核移植、手工核移植和转基因相关操作等提供不同类型的供体材料。
关键词：
广西巴马小型猪 成纤维细胞 细胞体外培养
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王超 李向臣 安志兴 张志平 舒建洪 张涌
将胎儿成纤维细胞悬浮于不同的冷冻保护液中 ,在不同的温度下进行冷冻保存试验。结果显示 ,当保护液中含有 90 0 m L / L胎牛血清 (FBS)时 ,- 196℃下保存的山羊胎儿成纤维细胞解冻后的细胞贴壁率高于- 80℃ ,且前者贴壁细胞增殖也较后者快 ,二者间差异显著 ;而在 - 2 0℃条件下只有一小部分细胞能够存活 ,与前两者相比差异极显著 ,说明 - 2 0℃不适合冷冻胎儿细胞。冷冻保护液中含有 10 0 m L / L二甲基亚砜 (DMSO)的保护效果明显好于 5 0 m L / L DMSO,二者间差异显著。用组织块法培养的细胞 ,在两种培养基 DMEM和 M199中添加 10...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
齐巍巍 唐泰山 王子玉 闫益波 钟部帅 吴勇聪 张常印 茆达干 王锋
为研究IRF-1基因在抗病毒方面的作用,将IRF-1基因转染牛胎儿成纤维细胞,制备了瞬时表达IRF-1基因的转基因细胞,再将携带单股正链RNA的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)作用于上述转基因细胞,观察该病毒在转基因细胞和非转基因细胞上的滴度变化及2种细胞形态、增殖、凋亡和基因表达情况上的差异。结果显示:与非转基因细胞相比,病毒在转基因细胞上滴度显著提高,病毒作用48和72 h后转基因细胞病变程度明显低于非转基因细胞;流式细胞仪检测发现72 h时细胞凋亡率显著降低,荧光定量PCR检测结果显示,转基因细胞中IRF-1基因的表达水平显著提高。结论:IRF-1基因具有促进细胞抗BVDV感染的作用。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
孔祥峰 胡元亮 刘家国 张宝康 陈玉库 王德云
将安全浓度范围内的黄芪多糖、当归多糖、蜂胶多糖、淫羊藿多糖、板蓝根多糖、黄芪黄酮、蜂胶黄酮、淫羊藿黄酮、黄芪皂苷和人参皂苷等 10种中药成分分别加入已培养 2 4h、刚形成单层的鸡胚成纤维细胞 (CEF)中 ,在加药后12 ,2 4 ,36 ,4 8和 6 0h用MTT法测定它们对CEF增殖的影响。结果表明 ,黄芪皂苷、黄芪多糖、板蓝根多糖和蜂胶黄酮主要表现为促进增殖 ;淫羊藿多糖主要具抑制效应 ;其他 5种中药成分在某些浓度和时间点能促进增殖 ,而在某些浓度和时间点则抑制增殖 ,并有一定的量效和时效关系。
关键词：
中药成分 鸡胚成纤维细胞 细胞增殖
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
华再东 徐国旗 毕延震 肖红卫 华文君 刘西梅 郑新民
为研究供体细胞不同处理方法对核移植重构胚发育能力的影响,分别用血清饥饿不同时间和传代次数的供体细胞进行核移植,比较重组胚的卵裂率和囊胚率.结果发现,饥饿0、2、4、8d的核供体细胞,重组胚在卵裂率上没有表现显著的差异,而饥饿2d和4d试验组的囊胚率却显著高于其他组;以传代0、2、4、8代的细胞作为供体细胞进行核移植,未经传代的细胞直接作为核供体卵裂率为57.69%,明显低于经过传代的细胞;细胞的传代次数在重组胚卵裂率上并未表现出明显的不同,但传至第4代细胞构成重组胚的卵裂率和囊胚率最高(86.29%和23.36%).试验选取饥饿处理2d、传4代的成纤维细胞作为核移植的供体,挑选发育良好的重组胚...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李彦美 马静 张志伟 李希阳 文渚媛 徐江昊 陶宁
【目的】研究丁香酚诱导癌相关成纤维细胞(CAF)的凋亡表现及其相关机制,为丁香酚的开发利用提供参考。【方法】用0(CK),30,60,90,120μmol/L丁香酚处理正常成纤维细胞(NF)24 h后,用MTT法检测细胞活力。用0(CK),30,60,90,120,150,180μmol/L丁香酚处理CAF细胞24 h后,用MTT法检测细胞活力。用0(CK),30,60μmol/L丁香酚处理CAF细胞24 h,用Annexin V-FITC和PI双染色法对细胞染色后进行流式细胞分析。用60μmol/L丁香酚处理CAF细胞0(CK),15,30,60,120 min,用Western blotting法检测凋亡相关蛋白表达水平的变化。【结果】30～120μmol/L丁香酚处理对NF细胞活力无显著影响;30～180μmol/L丁香酚处理对CAF细胞活力有显著或极显著的抑制作用,丁香酚对CAF细胞的半数抑制浓度为84.47μmol/L。60μmol/L丁香酚能够显著诱导CAF细胞凋亡。凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、P-P53、Caspase 9、Cleaved Caspase 3、Cytochrome C参与了丁香酚诱导的CAF细胞凋亡调控过程。【结论】丁香酚对CAF细胞有抑制作用,其作用可能是通过P53蛋白途径和内源性凋亡途径实现的。
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘通 王恒 李运生 张运海
为研究克隆黄淮白山羊耳部皮肤成纤维细胞(cGSF)的体外培养及其生物学特性。通过组织块接种培养法和胰蛋白酶消化法均可以获得原代cGSF,但在接种培养24 h后,组织块法收获的细胞贴壁率和细胞量要明显高于胰酶消化法。就生长特征而言,cGSF的生长曲线也呈现典型"S"型,到达指数增长期、平台期的时间分别为第3,6天,早于普通黄淮白山羊的皮肤成纤维细胞(GSF),后者分别为第4,8天。cGSF原代(P0)、第2代(P2)、第8代(P8)细胞的染色体数目异常率均高于相同代数的GSF。在相同转染条件下,cGSF在转染p EGFP-N1后,再经G418筛选亦可形成克隆点,扩增获得阳性细胞系。总之,源自克隆...
关键词：
体细胞克隆 山羊 成纤维细胞 生物学特性
[期刊] 中国农业科学
[作者]
邓彦飞 刘庆友 邓海莹 罗婵 杨素芳 石德顺
【目的】转录因子Oct4、Nanog是调节干细胞多能性相关的转录因子,在干细胞的分化和胚胎发育中有重要作用。本研究旨在克隆水牛Oct4和Nanog基因、分析基因序列和蛋白结构、构建逆转录表达载体,并在水牛体细胞中表达,为进一步研究其在水牛早期胚胎发育中的作用,以及为建立水牛胚胎干细胞系和诱导多能干细胞系(iPSC)奠定基础。【方法】分别从水牛生殖嵴和体细胞中提取RNA和DNA,将RNA反转录成第1链cDNA,参照牛基因序列(Oct4:NM_174580,Nanog:NM_001025344)设计特异性引物,采用RT-PCR和PCR分别扩增Oct4和Nanog的编码区序列(the coding ...
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