【目的】卵黄原蛋白受体(vitellogenin receptor,VgR)是介导昆虫卵黄原蛋白胞吞作用的主要受体,通过RNA干扰(RNAi)方法研究甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)VgR的功能,为深入了解甜菜夜蛾生殖生理的分子机制及开发有效防治新方法提供依据。【方法】以甜菜夜蛾雌成虫腹部的cDNA为模板,通过PCR克隆得到甜菜夜蛾VgR基因片段,其包含配体结合域功能区。绿色荧光蛋白基因(GFP)片段通过特异性引物从笔者实验室保存的GFP质粒上扩增。将VgR和GFP目的片段连入pMD-19T载体后进行测序,利用DNAMAN软件分析基因序列的准确性。以测序验证正确的质粒作为DNA模板,利用带T7启动子的引物进行PCR扩增。用T7 RiboMAXTM Express RNAi System合成试剂盒合成VgR-dsRNA和GFP-dsRNA。应用10μL微量进样器在化蛹第2、6天的甜菜夜蛾雌蛹腹部注射3μL双链RNA(2μg·μL-1)。利用RT-qPCR技术检测甜菜夜蛾刚羽化、羽化24 h、羽化48 h雌成虫的VgR表达量变化,同时统计对照组(空白对照、注射GFP-dsRNA)和处理组(注射VgR-dsRNA)甜菜夜蛾的羽化率及单雌产卵量。【结果】扩增得到VgR和GFP基因片段,大小分别为327和417 bp。RT-qPCR检测结果表明,与对照组相比,注射dsRNA后甜菜夜蛾的VgR表达水平显著下降。对于刚羽化、羽化24 h、羽化48 h的雌成虫,注射VgR-dsRNA处理组的VgR表达量相比注射GFP-dsRNA的对照组分别下降了79.35%、84.22%、67.68%。通过解剖观察刚羽化、羽化24 h、羽化48 h的甜菜夜蛾卵巢,发现注射VgR-dsRNA处理组与注射GFP-dsRNA对照组相比,卵巢发育进度显著推迟。对于羽化24 h的甜菜夜蛾,与注射GFP-dsRNA组相比,注射VgR-dsRNA处理组卵巢管长度下降了23.92%;注射GFP-dsRNA组的卵巢成熟卵粒较多,平均直径为(0.46±0.05)mm,而注射VgR-dsRNA处理组成熟卵粒数量较少且相对较小,平均直径为(0.23±0.02)mm。注射GFP-dsRNA组和VgR-dsRNA组的羽化率无显著差异。注射VgR-dsRNA处理组的单雌平均产卵量只有170粒,而对照组(空白对照和注射GFP-dsRNA)单雌平均产卵量可达到451粒和420粒,处理组与对照组的产卵量存在显著差异。【结论】通过体外注射dsRNA的方法研究VgR的功能,能够显著降低VgR表达。VgR在甜菜夜蛾的生殖中起着不可替代的作用,直接影响甜菜夜蛾卵巢的发育与产卵量,可以作为控制甜菜夜蛾的潜在靶标。

【目的】制备甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)多克隆抗体,并检测甜菜夜蛾不同发育时期血淋巴中的Vg蛋白表达量变化,为进一步研究Vg转运与利用机制以及生物学功能打下基础。【方法】以羽化24 h的甜菜夜蛾雌成虫c DNA为模板,通过PCR扩增得到甜菜夜蛾Vg基因片段,其包含vitellogenin-N结构功能区。将Vg目的片段连入pMD-19T载体后进行测序,利用DNAMAN软件分析该基因序列的准确性及编码蛋白的特性。将测序正确的Vg基因片段通过Nde

采用RNA干扰技术,通过腹腔注射法将甜菜夜蛾信息素结合蛋白1(SexigPBP1)双链RNA导入雄蛾体内,48 h后定量PCR检测表明,SexigPBP1的mRNA表达量被敲减90%以上;同时,触角电位(EAG)测定结果表明,注射处理48 h后雄蛾对雌蛾性信息素主组分Z9,E12-14∶Ac的EAG反应降低了约60%,证明SexigPBP1在雄蛾对该组分的感受中起重要作用。

【目的】克隆家蚕卵黄原蛋白受体(vitellogenin receptor,VgR),分析其在昆虫细胞中的表达特征,了解正常VgR和突变VgR的表达模式,为阐明其生物学功能提供参考依据。【方法】基于家蚕VgR的基因编码序列设计特异引物,扩增的目的片段连接到载体pET28a上,构建原核表达载体,转化E.coil BL21(DE3)表达菌株,IPTG诱导获得目的蛋白;用镍柱亲和层析方法纯化诱导表达的家蚕VgR肽蛋白;将纯化后的肽蛋白制备BmVgR的兔源多克隆抗体;PCR扩增获得大造和突变型白妙卵(scanty vitellin,vit)的LBD1+EGF1结构域(C11D和C11V)片段,连接到细...

【目的】围食膜(peritrophic membrane,PM)是衬托于昆虫中肠内的一种无脊椎动物特有的几丁质—蛋白复合结构,它能够促进食物消化,保护消化道免受微生物入侵。昆虫肠粘蛋白(ⅡM)是其重要组分之一。因此,作为中肠防御系统的PM已成为害虫生物防治的新靶标。分离和鉴定甜菜夜蛾肠粘蛋白基因cDNA。【方法】以甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)中肠为材料,依据stratagene公司试剂盒方法,构建甜菜夜蛾中肠cDNA表达文库。依据现代免疫学原理,利用粉纹夜蛾肠粘蛋白特异性多克隆抗体(anti-ⅡMantiserum)筛选该文库。【结果】cDNA表达文库滴度为8.51×106p...

【目的】探讨邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP)对诱导雄性两栖动物肝细胞合成卵黄蛋白原(Vitellogenin,VTG)的影响。【方法】将中国林蛙(Rana chensinensis)雄性成体分别暴露在含10-7,10-6,10-5,10-4 mol/L DEHP的水体中,以自来水为对照,并分别于暴露20,30和40d时取肝脏制作石蜡切片,用免疫组织化学方法检测肝细胞中雌激素受体(Estrogen receptor,ER)和VTG的表达情况。【结果】用不同浓度DEHP处理后,林蛙肝细胞中ER和VTG的相对表达量均显著或极显著高于对照组,...

为探究卵黄蛋白受体(Vitellogenin receptor,Vtgr)在双须骨舌鱼性腺发育的作用及组织表达规律,本研究运用RACE技术首次克隆获得双须骨舌鱼vtgr cDNA全序列,该序列全长为2 841 bp,开放阅读框(ORF)为2 556bp,编码氨基酸851个,5’端非编码区26 bp,3’端非编码区258 bp。生物信息学分析显示,vtgr蛋白分子质量为93.6 ku,等电点为4.78,含有8个低密度脂蛋白受体A结构域(LDLa),5个低密度脂蛋白受体YWTD结构域(LY),2个类表皮生长因子结构域(EGF),1个钙结合类表皮生长因子结构域(EGF-CA),1个跨度为23个氨基酸的跨膜结构域,属于极低密度脂蛋白受体(vldlr),是亲水性跨膜蛋白。多序列比对分析表明,双须骨舌鱼vtgr高度保守,与美丽硬仆骨舌鱼(Scleropages formosus)相似度最高为95.96%。系统进化树分析发现,与美丽硬仆骨舌鱼聚为一支,与鲽形目、鲤形目、鲑形目亲缘性较远。qRT-PCR结果分析发现,双须骨舌鱼vtgr在雌雄鱼的8个不同组织中均有表达,在卵巢和精巢中的相对表达量显著高于鳃、肝、脾、心脏、头肾、脑等组织(P<0.05)。此外,vtgr在雌雄鱼性腺发育Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期表达分析表明,在卵巢中vtgr相对表达量依次递减,且Ⅱ期显著高于Ⅲ和Ⅳ期(P0.05),但Ⅱ和Ⅲ期表达量显著低于卵巢(P<0.05)。研究表明,vtgr基因编码区序列有较高保守性。Vtgr在双须骨舌鱼前期卵巢发育中发挥着重要作用。

通过比较几种已发表夜蛾科昆虫的信息素结合蛋白(PBP)氨基酸序列,设计合成一对简并性引物,利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术从甜菜夜蛾(SpodopteraexiguaHübner)雄虫触角扩增得到2个分别为275bp和281bp的cDNA片段SexigPBP1和SexigPBP2,其分别由92个氨基酸残基和94个氨基酸残基组成。通过在GenBank中进行序列的同源性比较,表明这2个序列与已知几种昆虫的PBP氨基酸序列具较高同源性。

【目的】从甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)成虫触角中克隆气味受体基因,研究受体基因在虫体不同组织和触角不同感受器中的表达分布,从而探讨受体基因的功能。【方法】通过PCR结合RACE技术克隆气味受体基因的全长序列,利用实时定量PCR检测其在不同组织中的表达,采用原位杂交确定其在触角不同感受器中的分布。【结果】通过同源克隆的方法从甜菜夜蛾触角中获得1条740 bp的基因片段,通过RACE技术获得全长序列并命名为SexiOR18(GenBank登录号JN873314)。SexiOR18 cDNA全长1 618 bp,开放阅读框长度为1 194 bp,编码398个氨基酸。序列比对和进化树...

从成熟的克氏原螯虾卵巢中提取总RNA,通过同源克隆得到了卵黄蛋白原受体c DNA部分序列,长度为506 bp,在NCBI网站上进行比对后发现,其与斑节对虾、短沟对虾、罗氏沼虾的卵黄蛋白原受体(Vg R)c DNA序列有较高的相似性。采用实时荧光定量PCR方法,测定了卵巢不同发育时期卵巢和肝胰腺两个组织中卵黄蛋白原受体m RNA的相对表达水平。结果显示,卵巢是卵黄蛋白原受体基因表达的主要部位,而肝胰腺只能检测到少量表达,卵黄蛋白原受体基因在卵巢的卵原细胞增殖期相对表达量最高,随后下降,成熟期达到最低值,恢复期开始回升。结合卵巢不同发育阶段卵巢质量的变化计算表达总量,结果发现,卵黄蛋白原受体基因的...

十足目甲壳类卵巢中卵黄的来源,在过去的几十年研究中一直存在争议,内源性合成和外源性合成都有报道。本文以雌性中国对虾为实验材料,根据组织学观察确定其发育阶段,试验虾可以分为:卵巢未发育期;卵黄发生前期;初级卵黄发生期和次级卵黄发生期4个时期。从处于不同卵巢发育期对虾的卵巢和肝胰腺中提取总RNA,用RT-PCR的方法初步探讨不同发育期的中国对虾卵巢和肝胰腺中卵黄蛋白原mRNA的表达,确定是否存在卵黄蛋白原的合成功能。结果发现,从卵巢未发育期到次级卵黄发生期的卵巢和肝胰腺中都有卵黄蛋白原mRNA的表达,说明二者为卵黄蛋白的合成部位。

采用ELISA方法、分光光度计法和组织学方法,系统研究了不同年龄小体鲟(Acipenser ruthenus)血清卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vg)、血清钙离子(Calcium,Ca2+)含量与卵巢发育变化的关系。结果表明:血清Vg浓度、Ca2+浓度与卵巢的发育时期相关;在卵黄沉积期内,血清中Vg浓度与Ca2+浓度呈线性正相关(R2=0.9264);卵黄生成前期和沉积初期,血清中Vg浓度和Ca2+含量较低;卵黄沉积期内,卵母细胞由沉积初期的0.56mm增大到卵黄沉积末期的2.01mm,血清Vg质量浓度由110.65μg/mL上升到242.22μg/mL,血清Ca2+浓度由2.34mo...

通过柱层析方法获得了艾蒿的苯、乙酸乙酯、丙酮和乙醇淋洗物 ,比较了这 4种淋洗物对甜菜夜蛾产卵的忌避作用和抑制作用的差异。结果显示 ,丙酮淋洗物的产卵忌避作用和抑制作用最好 ,其次是乙酸乙酯淋洗物 ,而苯和乙醇淋洗物的作用较小

采用腹腔注射17β-雌二醇的方法诱导雄性金鱼卵黄原蛋白产生,注射浓度为0.05mg·g-1BW,诱导2周后取尾静脉血,离心分离血浆,进行血浆常规聚丙烯酰胺凝胶电泳,通过对卵黄原蛋白特性基团磷、脂和糖蛋白的染色,确定了卵黄原蛋白在电泳图谱上的位置,开发了一种简便、高效的定性卵黄原蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳法。电泳结果表明,在0.05mg·g-1BW的注射浓度下,2周后17β-雌二醇诱导了雄性金鱼卵黄原蛋白产生,并通过ELISA检测卵黄原蛋白的平均含量为690.2ng·mL-1,与对照组雄性金鱼平均含量为10.7ng·mL-1的差异极显著(P<0.01),比雌性对照组检出量285.5ng·mL-1高...

注射苯甲酸雌二醇诱导雄性大阪鲫产生雌性特异血清蛋白(卵黄蛋白原),随着诱导天数的增加,血清中的钙离子浓度升高,同时血清中的卵黄蛋白原的含量也相应增加。在此过程中肝细胞的细胞质中存在大量的钙离子,并进行着旺盛的蛋白合成。雌鱼和被诱导的雄鱼一样在肝细胞内也存在大量的钙离子。正常雄鱼的肝细胞不合成卵黄蛋白原,只有很少的钙离子存在。腹腔注射氯化钙使卵母细胞的卵径增大(实验组为 1.08±0.14mm;对照组为 1.04±0.14mm),并使卵母细胞的蛋白含量升高,同时卵泡膜上毛细血管的分布更为稠密,这表明钙离子可促进卵母细胞的发育和蛋白的吸收。