依据甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)外壳蛋白(CP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针,经过对反应体系和反应条件的优化,建立了特异、灵敏、高效的SPFMV实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明:该方法能检测到目的病毒,标准曲线的斜率和相关系数分别为-3.307和0.998,扩增效率为100.6%。最低可检测到约5.46个拷贝的阳性质粒,灵敏度比常规PCR高2个数量级。建立的实时荧光定量PCR方法可用于田间样品的检测,为SPFMV的早期预警和流行学研究提供了技术手段。

【目的】甘薯病毒病（ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ｓｐｖｄ）是甘薯上的毁灭性病害之一，严重时可造成９０％以上的产量损失。论文旨在对甘薯ｓｐｖｄ染病植株中甘薯羽状斑驳病毒（ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｆｅａｔｈｅｒｙ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ，ｓｐｆｍｖ）和甘薯褪绿矮化病毒（ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ，ｓｐｃｓｖ）２种病毒的复合侵染情况进行研究，建立ｓｐｖｄ荧光定量ｒｔ－ｐｃｒ快速检测方法，为ｓｐｖｄ的早期预警和流行学研究提供技术手段。【方法】选取重庆地区具有不同ｓｐｖｄ典型症状的甘薯品种（系）叶片作为试验材料，对其进行症状和ｓｐｆ．．．

【目的】甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)侵染甘薯造成重要危害,本研究旨在利用反转录环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)建立一种快速、高效检测SPFMV的方法。【方法】从Gen Bank上获得SPFMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因的核苷酸序列,利用Primer Explorer V4设计4条RT-LAM

在大田生产中,甘薯极易受到甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)和甘薯矮化退绿病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)的混合侵染,导致甘薯产量和品质严重下降,因此构建能同时检测SPFMV和SPCSV两种病毒的检测技术体系对甘薯病毒病(sweet potato virus disease,SPVD)的预防具有重要意义。RT-PCR病毒检测技术具有灵敏度高、特异性强的优点。针对SPFMV和SPCSV病毒分别设计4对和3对特异性引物,通过单一RT-PCR检测技术筛选出特异性强的引物和最佳退火温度;在双重RT-PCR检测体系中,针对SPFMV和SPCSV两种病毒的引物浓度组合设置5个处理,优化双重RT-PCR病毒检测技术体系。单一RT-PCR检测结果表明,SPFMVS2/A2和SPCSVS2/A2引物的特异性最强,目的片段大小为461bp,对于SPCSV病毒来说,SPCSVS2/A2引物的特异性最强,目的片段大小为304bp,最佳退火温度为56℃;在双重RT-PCR检测技术体系中,SPFMV/SPCSV的引物组合浓度比为1∶3时,目标片段扩增效果最好。对两种病毒最低检测浓度的测试结果表明,SPFMV和SPCSV两种病毒RNA的最低检测浓度相当于模板RNA浓度的10-4μL。双重RT-PCR检测技术体系的构建,为大田生产中受SPFMV和SPCSV共侵染的甘薯病毒病的预防提供技术支持。

【目的】使用简并引物RT-PCR方法并结合序列测定与分析，为甲型香石竹斑驳病毒属（Alphacarmovirus）、乙型香石竹斑驳病毒属（Betacarmovirus）和丙型香石竹斑驳病毒属（Gammacarmovirus）病毒建立一种快速、灵敏、广谱的检测鉴定方法。【方法】通过基因组序列的多重比对分析，在依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRp）基因的保守区域设计1对简并引物Carmo-F2/Carmo-R2，在引物5′端分别加入非互补的富含AT序列（AATAAATCATAA）形成引物Carmo-F2a/Carmo-R2a，测试简并引物RT-PCR方法的广谱性、特异性和灵敏度，并对PCR产物进行测序、序列分析和系统发育分析。利用该方法对来自厦门的扶桑（Hibiscus rosa-sinensis）样品进行病毒检测。【结果】利用Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a两对引物建立的RT-PCR方法，扩增甲型、乙型和丙型香石竹斑驳病毒属病毒的部分RdRp基因，扩增片段分别约为500和550 bp。该方法成功用于检测甲型香石竹斑驳病毒属的香彩雀花碎色病毒（angelonia flower break virus,AnFBV）、小花矮牵牛斑驳病毒（calibrachoa mottle virus,CbMV）、香石竹斑驳病毒（carnation mottle virus,CarMV）、天竺葵花碎色病毒（pelargonium flower break virus,PFBV），乙型香石竹斑驳病毒属的木槿褪绿环斑病毒（hibiscus chlorotic ringspot virus,HCRSV），丙型香石竹斑驳病毒属的甜瓜坏死斑点病毒（melon necrotic spot virus,MNSV），显示出良好的广谱性。特异性检测表明，简并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a在玉米褪绿斑驳病毒（maize chlorotic mottle virus,MCMV;Machlomovirus）、天竺葵线纹病毒（pelargonium line pattern virus,PLPV;Pelarspovirus）、香石竹环斑病毒（carnation ringspot virus,CRSV;Dianthovirus），健康的西瓜、甜瓜、南瓜、大豆、豌豆植物未扩增到预期大小的条带。灵敏度检测表明，简并引物Carmo-F2/Carmo-R2最低可检测到10-2稀释液，简并引物Carmo-F2a/Carmo-R2a可检测到10-3稀释液，在5′端加入非互补的富含AT序列可以提高简并引物RT-PCR检测方法的灵敏度。BLAST分析表明，测定的序列均与相应病毒种类具有最高序列一致性。部分RdRp基因氨基酸序列的系统发育分析结果符合目前通读病毒亚科（Procedovirinae）病毒的分类情况，且可以把病毒鉴定到种的水平。采集13份疑似病毒症状的扶桑样品，均检出木槿褪绿环斑病毒。【结论】基于简并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a的RT-PCR方法，可用于甲型、乙型和丙型香石竹斑驳病毒属病毒的筛查检测，结合序列分析及系统发育分析可进行病毒种类的快速鉴定，并有助于发现新的病毒种类。厦门扶桑植物受到木槿褪绿环斑病毒的侵染。

为了建立一种能在临床上快速、准确检测杂交鳢弹状病毒(HSHRV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,利用PCR技术扩增HSHRV-C1207 G蛋白的全长序列,构建重组质粒,作为荧光定量PCR的标准品,根据HSHRV-C1207 G蛋白的保守序列,设计合成了一对能特异性扩增143 bp片段的引物和TaqMan探针,以标准品为模板建立HSHRV的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的灵敏度、可重复性和特异性进行评价。结果显示:建立的荧光定量PCR检测方法标准曲线有较好的线性关系,相关系数(R2)为0.999,斜率为-3.290;荧光定量PCR最低可以检测到10个病毒核酸分子拷贝,...

【目的】建立禽坦布苏病毒（ＡｖｉＡｎ Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ，ＡＴｍｖ）ＴＡｑｍＡｎ实时荧光定量ＰＣｒ检测方法。【方法】根据ＡＴｍｖ非结构蛋白ｎｓ１的基因特征，设计特异性的引物和探针，建立基于ＴＡｑｍＡｎ探针检测ＡＴｍｖ的实时荧光定量ＰＣｒ检测方法，对其特异性、重复性进行检测。用建立的ＴＡｑｍＡｎ实时荧光定量ＰＣｒ检测方法和之前建立的ｒＴ－ＰＣｒ方法同时对临床１５份疑似ＡＴｍｖ感染的病料进行检测，计算其符合率。【结果】成功建立了检测ＡＴｍｖ的实时荧光定量ＰＣｒ检测方法，当ｎｓ１基因含量为（２．６７×１０２）～（２．６７×１０７）拷贝／μＬ时有良好的线性扩增，其扩增相关系数为０．９９８，扩增．．．

为了建立一种快速检测小反刍兽疫病毒的方法。根据Gen Bank中公布的PPRV Nigeria75/1株H基因序列设计2对引物,PCR扩增出1 830 bpH基因,构建标准质粒p MD-18-H。以标准质粒优化反应条件,建立了小反刍兽疫病毒H基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。最优反应体系25μL:2×SYBR qPCR Mix 12. 5μL,模板DNA 1μL,特异引物各0. 2μL(0. 2μmol/L),DEPC H2O 10. 5μL;最佳反应条件:94℃2 min; 94℃5 s,57℃30 s,40个循环,Ct值与标准质粒模板浓度在3. 28×104～3. 28×10-2copies/μL 7个浓度梯度呈良好线性关系y=-2. 913x+36. 904,斜率为-2. 913,扩增效率120. 5%,相关系数R2=0. 994。建立的实时荧光定量PCR检测方法比普通PCR灵敏度高10 000倍,稳定性好,特异性强,对PPRV的准确诊断和定量检测具有重要意义。

利用PCR技术扩增出大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus,GSIV)主要衣壳蛋白(MCP)编码区长度为1 392 bp的片段,克隆到pMD19-T载体上,构建重组质粒pMD19-T-MCP。经PCR鉴定确认正确后,以10倍梯度稀释pMD19-T-MCP重组质粒,作为标准模板进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增,制作标准曲线,建立了大鲵虹彩病毒的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。制作的标准曲线有极好的线性关系,且线性范围宽,相关系数为0.990 19。组内重复试验的CT值标准偏差为0.52%。检测结果显示,该方法对大鲵虹彩病毒的检测有高度的特异性,与锦鲤疱...

【目的】建立一种能在临床上快速、准确检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中已公布的PCV-2陕西分离株的全基因序列,在PCV-2的ORF2核苷酸序列的保守区域,设计合成1条TaqMan探针和1对特异性引物;利用设计的引物扩增ORF2部分基因并鉴定后,回收PCR扩增产物,连接pMD19-T载体,转化DH5α大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR及测序鉴定后提取质粒,作为荧光定量PCR的标准品;以标准品为模板建立检测PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的灵敏度、稳定性和特异性进行评价;用建立的荧光定量...

猪圆环病毒２型（ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ２，ｐｃｖ２），是感染猪ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ的一种单链ｄｎａ病毒。建立一种快速、灵敏的检测方法，对于ｐｃｖ２感染猪的筛选和疾病预防非常重要。根据ｐｃｖ２ ｏｒｆ２基因保守区，设计了荧光定量聚合酶链式反应（ｐｃｒ）引物，利用ｓＹＢｒ Ｇｒｅｅｎ作为荧光染料建立了一种定量检测ｐｃｖ２的ｐｃｒ方法。结果表明：该方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的优点，每微升的最低检测限低至１０１拷贝ｄｎａ。利用该方法对３４份ｐｃｖ２阳性临床样本进行检测，检测符合率为１００％，明显高于普通ｐｃｒ方法的５０．０％。因此，本研究建立的ｐｃｖ２实时．．．

【目的】建立一种实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)检测番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)的方法,用于测定田间植株样品及其传毒媒介烟粉虱(Bemesia tabaci)中To CV的含量。【方法】首先根据To CV次要外壳蛋白(minor coat protein,CPm)基因的保守区域序列,运用Primer 3.0在线软件设计To CV特异性检测引物To CVq F和To CVq R,并通过Primer-BLAST进行比对保证检测引物的特异性;其次分别以感染To CV、番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)的番茄样品为模板,应用该对引物进行To CV基因片段的克隆鉴定;将阳性克隆样品放入含有氨苄青霉素的LB液体培养基中扩大培养,并提取质粒,获得To CV质粒标准品,将To CV质粒标准品按10倍浓度梯度稀释,建立标准曲线;同样以按10倍浓度梯度稀释的To CV质粒标准品为模板,同时运用RT-q PCR和反转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),比较这两种方法检测To CV的灵敏度;最后应用该方法对田间采集的8份疑似To CV感染的番茄样品以及获毒24 h后的单头烟粉虱进行病毒检测,结合扩增曲线、熔解曲线和Ct值对待测样品中的带毒情况和带毒量进行测定。【结果】在感染To CV的番茄样品和阳性对照中,引物To CVq F和To CVq R均能够特异扩增出To CV CPm基因片段,目的片段大小为230 bp,而在感染TYLCV、TSWV的番茄样品、健康番茄样品和空白对照中,该对引物则无法扩增出特异性目的条带,说明该对引物特异性较强;构建To CV的RT-q PCR标准曲线结果表明,随着To CV质粒标准品模板浓度逐渐降低,Ct值出现递增趋势,并且在质粒标准品浓度2.7×103—2.7×109 copies/μL范围内,To CV标准曲线Ct值同质粒标准品浓度之间呈现良好的线性关系,扩增效率为100%,决定系数R2=0.9911,直线方程为y=-3.32×lgx+40.06(y代表循环阈值即Ct值,x代表质粒初始浓度),该曲线将用于To CV含量的测定。RT-q PCR灵敏度检测结果表明,该方法能够检测出的To CV质粒标准品最低浓度为2.7×103 copies/μL,而常规RT-PCR仅能够检测出2.7×105 copies/μL的病毒样品,通过RT-q PCR法检测To CV比常规RT-PCR法灵敏100倍。该方法能成功检测出田间植物样品携带To CV情况,8份疑似To CV感染的番茄样品中有6份携带To CV,同常规RT-PCR检测结果一致,结合标准曲线计算出感染To CV的番茄样品带毒量分别为2.48×105、2.21×105、7.97×104、3.74×107、3.37×107、2.78×106 copies/μL;烟粉虱获毒24 h后,携毒率为100%,单头烟粉虱最高带毒量为2.55×104 copies/μL,最低为6.46×102 copies/μL。【结论】建立的RT-q PCR检测To CV的方法特异性强、灵敏度高,可以实现植物样品和媒介昆虫携带To CV情况和病毒含量的检测,可为To CV的准确、有效监测和预警提供技术支持。

针对甘薯生产上发生为害严重的甘薯RNA病毒—甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)、甘薯G病毒(SPVG)和甘薯C病毒(SPVC),建立了多重RT-PCR检测方法。首先根据GenBank中收录的这些病毒的外壳蛋白(CP)基因的保守序列，利用Premier 5.0软件分别设计并合成了上述4种病毒的特异性引物；以4种病毒的下游特异性引物合成的cDNA为模板，在同一体系中同时加入上述4种甘薯病毒引物进行PCR扩增，初步建立这4种甘薯RNA病毒的最佳多重RT-PCR体系；通过对该多重RT-PCR体系的退火温度、延伸时间、dNTPs量、模板量、引物浓度等条件的优化，建立了能够同时检测这4种甘薯RNA病毒的最优四重RT-PCR检测体系，并对优化的多重RT-PCR体系进行了挑战测试和灵敏度测试。试验结果显示，优化的多重RT-PCR体系，各病毒引物之间不会出现交叉干扰，所扩增的4条目的条带清晰，能够明确区分上述4种甘薯病毒；挑战检测和灵敏度测试显示，此检测体系特异性强且灵敏度高。所建立的上述4种甘薯RNA病毒的多重RT-PCR检测方法能同时检测4种甘薯病毒，不仅准确灵敏，而且降低了检测成本，提高了病毒检测效率。

【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系...

在GenBank中搜寻虹彩病毒蛙病毒属主衣壳蛋白(MCP)基因序列并进行多重比较后,利用其中的保守序列,设计引物和Taqman探针,建立了虹彩病毒蛙病毒属实时荧光PCR检测方法。对荧光PCR反应条件进行优化,评估该检测方法的特异性、稳定性和重复性,利用10倍系列稀释法检验其灵敏度并与常规PCR做了比较。结果显示,该方法对虹彩病毒蛙病毒属成员(新加坡石斑鱼虹彩病毒除外)的检测有高度的特异性,与淋巴囊肿病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒等其他水生动物病毒之间均无交叉反应,有良好的特异性,检测总DNA灵敏度为4.5×10-3pg/μL,比传统PCR的敏感度高出100倍,可对低病...