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[期刊] 华北农学报
[作者]
翟玉山 彭磊 杨永庆 邓宇晴 程光远 郑艳茹 徐景升
为探索甘蔗条纹花叶病毒与甘蔗的互作机制，利用酵母双杂交技术筛选与ＳＣＳＭＶ互作的甘蔗因子基因，利用ＰＣＲ技术克隆了ＳＣＳＭＶ的ＨＣ－ＰＲｏ、Ｐ３Ｎ－ＰＩＰｏ、ＣＰ和ＶＰｇ的编码区，构建到酵母双杂交诱饵载体Ｐ ｇＢＫＴ７上，获得了Ｐ ｇＢＫＴ７－ＨＣ－ＰＲｏ、Ｐ ｇＢＫＴ７－Ｐ３Ｎ－ＰＩＰｏ、Ｐ ｇＢＫＴ７－ＣＰ和Ｐ ｇＢＫＴ７－ＶＰｇ ４个诱饵载体。结果显示，将重组质粒转化酵母Ｙ２Ｈｇｏｌｄ酵母菌株后，酵母菌株在Ｓｄ／－ＴＲＰ平板上生长良好，表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性；在Ｓｄ／－ＴＲＰ／Ｘ－α－ｇａｌ平板上长出白色菌落未变蓝，在Ｓｄ／－ｌｅｕ、Ｓｄ／－ＴＲＰ／－ａｄｅ、Ｓｄ／－Ｔ．．．
[期刊] 西南农业学报
[作者]
彭敏 苏绍萍 陈秀荔 杨春玲 朱威霖 王建平 曾地刚 李咏梅 赵永贞 陈晓汉
应用酵母双杂交体系，构建凡纳滨对虾ＩＨＨＮＶ ３个开放阅读框的酵母双杂交诱饵载体，并对该载体的表达产物对酵母细胞的毒性及其对报告基因的自激活作用进行检测，为运用酵母双杂交文库筛选与病毒互相作用的蛋白提供参考。对凡纳滨对虾ＩＨＨＮＶ病毒３个开放阅读框的基因片段进行ＰＣＲ特异性扩增，并运用ＩＮ－ＦｕｓＩｏＮ技术将该基因片段与双酶切的酵母双杂交诱饵质粒ＰＧＢＫＴ７进行连接，获得重组质粒ＰＧＢＫＴ７－ＣＰ、ＰＧＢＫＴ７－Ｎｓ１和ＰＧＢＫＴ７－Ｎｓ２，并进行自激活和毒性检测。结果表明，ＰＧＢＫＴ７－ＣＰ、ＰＧＢＫＴ７－Ｎｓ１和ＰＧＢＫＴ７－Ｎｓ２等３个重组质粒对ＭＥＬ１报告基因无自激活性；对ＡｕＲ１－Ｃ．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
胡湘云 高小龙 付向晶 王燕平 刘丹丹 常旭东 刘蓬 杜恩岐 王兴龙 党如意 杨增岐
【目的】应用酵母双杂交技术构建新城疫病毒的血凝素－神经氨酸酶（ＨＮ）蛋白线性中和表位区的诱饵载体ｐＧＢＫＴ７－ＨＮ－Ｎｅｕ，为筛选靶向新城疫病毒ＨＮ蛋白的中和性纳米抗体奠定基础。【方法】合成ＨＮ蛋白的线性中和表位区ＨＮ－Ｎｅｕ，将其克隆至酵母双杂交系统诱饵载体ｐＧＢＫＴ７中，构建诱饵载体ｐＧＢＫＴ７－ＨＮ－Ｎｅｕ，经酶切鉴定和测序验证正确后，将ｐＧＢＫＴ７－ＨＮ－Ｎｅｕ转化酵母菌Ｙ２Ｈ Ｇｏｌｄ，检测其在酵母细胞中的毒性和自激活作用。【结果】成功合成了ＨＮ－Ｎｅｕ，构建的ｐＧＢＫＴ７－ＨＮ－Ｎｅｕ在酵母细胞Ｙ２Ｈ Ｇｏｌｄ中无毒性和自激活能力。【结论】成功构建了诱饵载体ｐＧＢＫＴ７－ＨＮ－Ｎｅ．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
许媛 李铃仙 魏春茹 魏新燕 于秀梅 刘大群
ＳＫＰ２Ａ是调控细胞周期转录因子降解的Ｆ－ｂｏｘ蛋白。为研究该蛋白在小麦－叶锈菌互作过程的作用，首先克隆获得中国春小麦ＴＡ－ＳＫＰ２Ａ全长序列，然后将其与ＰＧｂＫＴ７载体连接，转入酵母Ｙ１８７感受态细胞中，构建酵母诱饵表达载体，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性和自激活效应。结果表明，ＴＡ－ＳＫＰ２Ａ编码区序列长度为１ １４６ ｂＰ，其ｏＲＦ区编码一条由３８２个氨基酸组成的多肽。在ｏＲＦ区两侧连接酶切位点（ＥｃｏＲⅠ和ｂＡｍ ＨⅠ），并将其与载体ＰＧｂＫＴ７连接，成功构建了包含目的基因的诱饵载体ＰＧｂＫＴ７－ＴＡ－ＳＫＰ２Ａ，且含重组诱饵质粒的酵母菌株在ＳＤ／－ＴＲＰ营养缺陷平板上生长良好，其．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李谋 王春丽 刘小林 张成岗
以人胎儿脑cDNA文库为模板克隆了钠钾泵β2亚基C末端编码区(N KAβ2ct),构建了表达载体pGBKT 7-NKAβ2ct,并对其进行了表达,对表达产物进行了检测。结果表明,N KAβ2ct长690 bp,pGBKT 7-NKAβ2ct酵母表达载体构建成功,在酵母中表达良好,可用于后续的酵母双杂交文库筛选工作。
关键词：
钠钾泵β2亚基 载体构建 酵母表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
许宗宏 郝青南 陈李淼 孙佃臣 田星星 单志慧
大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)是马铃薯Y病毒组(Potyvirus)成员之一,大豆花叶病毒病可造成大豆10%~30%的产量损失,并严重影响大豆的品质。不同株系间致病力差异源于它们在碱基序列上的差异。采用传统的抗病育种技术育成的抗病品种抗谱窄,品种抗性可因病毒株系的变异而丢失。依靠RNA引发的基因沉默改善植物的抗病毒能力是基于RNA i(RNA inference)原理建立的植物抗病毒新策略,本研究对来源于武汉SMV分离物的CP基因和Nib基因进行了克隆,通过对保守区域的扩增,采用Gateway技术构建了大豆抗花叶病毒的RNA干扰载体。为防治大豆花叶病毒新技术的...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
牛陆 赵倩倩 杨静 邢国杰 张伟 贺红利 杨向东
【目的】大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)病是中国大豆产区最主要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒品质。核糖核酸酶PAC1能够识别和降解植物RNA病毒或类病毒复制过程中产生的ds RNAs,从而有效抑制病毒在寄主中的复制与积累。PAC1的这一特点为广谱抗RNA病毒及类病毒转基因作物的创制和培育提供了有效的靶标基因。本研究利用转基因技术,将来源于粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的PAC1导入栽培大豆,研究过表达PAC1对大豆SMV抗性的影响,
[期刊] 中国农业科学
[作者]
何乙坤 钟敏 胡同乐 王树桐 段豪 丁丽 王亚南 曹克强
[目的]利用酵母双杂交系统筛选与苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)外壳蛋白(coat protein,CP)互作的寄主因子,利用生物信息学方法分析其在病毒与寄主互作过程中可能发挥的作用。[方法]首先构建ACLSV CP的酵母双杂交诱饵载体p GBKT7-CP,转化至酵母菌株Y2H gold中,测定转化菌在SD/-Trp、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade-X-α-Gal平板上的生长情况,从而判断其在酵母双杂交过程中对报告基因的自激活活性。将p GBKT7-CP及p GBKT7分别转化至酵母菌株Y2H gold,培养不同...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
梁芳 邓祖丽颖 许申平 张燕 崔波
【目的】建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)是侵染蝴蝶兰最主要的2种病毒,给蝴蝶兰产业造成巨大经济损失。本文建立了快速检测这2种病毒的方法,并为培育同时抗CyMV和ORSV的蝴蝶兰新品种奠定基础。【方法】根据2种病毒CP基因序列设计了2对特异性引物,运用RT-PCR方法同时检测这2种病毒,利用反义RNA技术构建2种病毒CP基因的融合表达载体。【结果】利用设计的特异性引物检测12株蝴蝶兰样品,有25%同时检测出2种病毒,在同一PCR反应体系中,扩增出2个目的条带清晰无杂带。从感病蝴蝶兰叶片总RNA中克隆出CyMV CP基因的125 bp片段和ORSV CP基因的164 bp片段。将CyMV的CP基因片段以3’→5’方向与表达载体p CAMBIA1300连接,命名为p CAMBIA1300-CyMV,经酶切及菌落PCR鉴定可获得125 bp的小片段;再将ORSV的CP基因片段以3’→5’方向与p CAMBIA1300-CyMV连接,命名p CAMBIA1300-CyMV-ORSV,经酶切及菌落PCR鉴定可获得289 bp的片段。【结论】所设计的2对特异性引物能够在同一PCR体系中快速高效地检测出CyMV和ORSV,含2种病毒CP基因的反义融合表达载体构建成功。
[期刊] 华北农学报
[作者]
林静 杨永庆 侯文焕 史晓蕾 张孟臣 谢令琴 杨春燕
为了建立以本氏烟为模式作物研究ＳＭＶ侵染机制的平台，以可系统侵染本氏烟的重组型ＳＭＶ分离物ＨＢＲＳ为毒源，构建感染ＨＢ－ＲＳ本氏烟的酵母双杂ｃ ＤＮＡ文库。利用ＳＭＡＲＴ技术获得本氏烟的双链ｃ ＤＮＡ文库，通过双酶切手段将ｃＤＮＡ文库构建至ｐＧＡＤＴ７－Ｓｆｉｉ载体上。检测结果显示，文库容量约为３．２×１０６ｃｆｕ，插入ｃＤＮＡ片段长度为０．７５～２．００ ｋＢ，平均长度大于１．００ ｋＢ，且多态性丰富，表明文库质量较好。该酵母双杂文库的构建为钓取与ＳＭＶ互作的寄主因子和系统性研究ＳＭＶ侵染机制奠定了物质基础。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
郑艳茹 翟玉山 邓宇晴 成伟 程光远 杨永庆 徐景升
针对已公布的１８个甘蔗花叶病毒（ＳＣＭＶ）全基因组序列，利用ＭＥＧＡ ５．１分析了其１１个蛋白（Ｐ１、ＨＣ－Ｐｒｏ、Ｐ３、６Ｋ１、ＣＩ、６Ｋ２、ＶＰＧ、ＮＩＡ－Ｐｒｏ、ＮＩｂ、ＣＰ－Ｃ和多聚蛋白）编码基因所受的选择压，并结合其编码蛋白的功能，预测了部分基因在ＳＣＭＶ进化过程中的角色和变异位点．结果显示：Ｐ１和ＣＰ－Ｎ端的变异性程度较大，Ｐ１蛋白多样性最高；ＣＰ－Ｃ端变异性和多样性均较低；ＰＩＰｏ受到的选择压最小，但多样性最低，可能是由于ＰＩＰｏ与Ｐ３共用一段编码序列．来源于甘蔗的ＳＣＭＶ多聚蛋白的第２ ８５３、２ ８９７和２ ９０４个氨基酸位点（在ＣＰ中部）分别为Ｔ、ｒ和Ｅ，而来源于玉米的ＳＣ．．．
关键词：
甘蔗花叶病毒 种群结构 选择压力
[期刊] 华北农学报
[作者]
贾慧 王艳辉 王进忠 王升启 董金皋
黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒是世界性分布的重要植物病毒,对农业生产危害较大。农作物感病多为复合侵染,症状表现较为复杂,急需建立快速、准确、能够一次检测多种病毒的检测方法。本研究根据3种病毒的外壳蛋白基因序列,设计引物和探针,制备基因芯片;用Cy3标记下游引物,RT-PCR扩增产物与芯片杂交,荧光扫描仪检测并分析信号。结果表明,该芯片可以从病毒侵染样本中检测到特异性识别信号,检测灵敏度比RT-PCR高10～100倍,该技术能对植物病毒做出快速、准确的检测。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
卢训 方琦 尹跃艳 秦西云 丁铭
用RT-PCR从感染烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的烟草样品中克隆该病毒的外壳蛋白基因,病毒外壳蛋白基因再亚克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,构建成重组原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导、Ni+NTA亲和柱纯化获重组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔,制备TMV外壳蛋白多克隆抗体,并用制备的多克隆抗体建立了更简便、经济、特异性更强的DOT-ELISA检测法。
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
石海英
根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白(Coat Protein CP)和移动蛋白(Movement Protein MP)基因序列合成了CP、MP基因的上下游引物,通过PCR扩增获得含有目的基因的片段,经过Sal I和Pst I双酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序,构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP,用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白,为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒互作的寄主因子、克隆寄主因子、推测其种类和功能奠定了基础。
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