【目的】自交不亲和性(self-incompatibility,SI)是显花植物在长期进化过程中形成的限制自交衰退、促进杂交优势的一种复杂而完善的重要遗传机制。通过对SI与钙共响应新基因BoSPx的克隆、时空特异性表达分析和筛选与其互作的蛋白,并对BoSPx在自花授粉后刺激柱头的响应机制进行研究,以期为甘蓝SI的深入研究提供依据。【方法】采用转录组测序、自花和异花授粉后差异筛选以及PCR克隆获得BoSPx。利用DNAMAN软件和Smart软件进行氨基酸序列比对和保守结构域分析,通过Expasy在线软件预测BoSPx蛋白分子量、等电点、二级结构和跨膜结构域;采用MEGA6.0软件中的邻接法构建BoSPx蛋白的系统发育树,并推测BoSPx蛋白在甘蓝自花授粉后的功能。利用RT-PCR技术进行组织特异性表达分析,通过qRT-PCR检测自花和异花授粉后BoSPx的相对表达量。构建GFP表达载体,共聚焦显微镜观察BoSPx的亚细胞定位;酵母双杂交技术寻找其相互作用的蛋白。【结果】克隆获得一个新基因——BoSPx,其含有1个外显子,无内含子,是单外显子结构。BoSPx的开放阅读框为396 bp,编码具有131个氨基酸残基的蛋白质。理论等电点pI为4.54,是一种亲水性蛋白,没有信号肽和跨膜域,含有3个保守的EF-hand模体(第48—60、64—80和81—96位)。BoSPx起始密码子上游启动子序列500 bp左右含有生长素响应应答元件。BoSPx在开花前1—2 d的柱头、萼片、叶片、花药、花瓣中均有表达,在柱头中表达量最高,并且在自花和异花授粉的柱头中表达量都是先升高后降低,在自花授粉15 min时表达量达到最高,而后急剧下降,下降的低值与开花前1—2 d的柱头峰值相当。亚细胞定位分析表明BoSPx蛋白定位于细胞核和细胞质中。酵母双杂交结果表明BoSPx与SRK、ARC1之间无相互作用,但与生长素家族蛋白BoSAUR71和BoPID均能互作。【结论】BoSPx受自花授粉显著诱导表达,可能是受生长素调节的钙结合蛋白,对SI和钙产生共响应;该蛋白具有多组织表达和核质同在的特性,表明BoSPx可能参与SRK-ARC1-ExO70A1途径以外的未知信号通路。

ACP5基因是参与植物体中脂肪酸代谢的重要基因之一,在甘蓝型油菜中该基因还未被深入研究。为了弄清楚BnACP5基因在甘蓝型油菜中的螺旋结构及功能,以湘油15为试材,采用同源克隆法得到一个与脂肪酸合成相关的基因BnACP5。BnACP5基因CDs序列长417 bp,共编码138个氨基酸。生物信息分析表明,BnACP5蛋白的相对分子质量15.25 ku,理论等电点(p I)为5.94,其不稳定参数为43.03,属于不稳定蛋白;其总疏水平均系数(GRAVY)为-0.148,是一种亲水性蛋白;不含跨膜结构,也不含

【目的】探究羽衣甘蓝裂叶表型形成的分子机制，研究BoLMI基因对裂叶形成的作用。【方法】以裂叶羽衣甘蓝DH系为试验材料，利用同源克隆技术，成功获取基因完整的cDNA序列，将其命名为BoLMI。【结果】序列分析发现，BoLMI基因全长531 个碱基对，共编码176个氨基酸，其蛋白分子量为20 789.35 Da，理论等电点为7.24。根据Pfam保守结构域分析，BoLMI蛋白包含homeobox保守结构域。系统发育分析结果显示，羽衣甘蓝的BoLMI基因与甘蓝型油菜以及结球甘蓝的BoLMI基因同属于一个分支，亲缘关系较近。BoLMI蛋白是位于细胞核内的可溶性蛋白，包含1个跨膜结构域，无信号肽序列。qRT-PCR分析表明，BoLMI基因在裂叶羽衣甘蓝的幼苗期表达水平较高，在莲座期表达水平较低；在羽衣甘蓝莲座期，裂叶品种不同部位叶片BoLMI基因的表达水平均高于圆叶品种，其中在第1片叶的表达量最高。裂叶品种和圆叶品种不同叶片BoLMI基因的表达量差异显著。【结论】推测BoLMI基因在羽衣甘蓝裂叶形成中起重要作用，为加速羽衣甘蓝叶形育种提供了理论基础。

以羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)野生型及其在选育过程中发现的2种花瓣数量变化的突变体品种为试材,通过RACE方法克隆了AGL6基因的同源基因,命名为BoaAGL6,并用半定量RT–PCR和实时荧光定量PCR分析了BoaAGL6在3种不同花型的羽衣甘蓝各类花器官的表达模式。结果表明:克隆的BoaAGL6基因长999 bp(GenBank登录号为KC984301),开放阅读框长759 bp,编码252个氨基酸;系统发育分析表明,BoaAGL6基因属于AGL6–like进化系;半定量RT–PCR和实时定量RT–PCR结果表明,BoaAGL6基因具有较宽泛的表...

水孔蛋白是位于质膜和液泡膜等生物膜上主要负责水分跨膜运输的通道蛋白。为了分析甘蓝型油菜种子萌发过程水分调控的分子机制，采用ＲＴ－ＰＣＲ法从甘蓝型油菜种子中克隆了液泡膜内在蛋白（ＴｏｎｏＰ ｌａｓＴ ｉｎＴＲｉｎｓｉＣ ＰＲｏＴｅｉｎｓ，ＴｉＰｓ）ＴｉＰ４；１基因片段序列，并对甘蓝型油菜种子ＴｉＰ４；１基因在种子萌发过程及干旱、低温和盐胁迫下的表达进行了ｑＲＴ－ＰＣＲ（ｑｕａｎＴｉＴａＴｉｖｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ）分析。结果表明，ＴｉＰ４；１基因在干种子中表达水平很低，但是在种子萌发过程中表达量增加。此外，在干旱、低温及盐的胁迫处理下，ＴｉＰ４；１基因的表达上调，结果暗示着该基因可能参与．．．

克隆并对溶血磷脂酸酰基转移酶时空表达和逆境表达进行分析,旨在为进一步研究其生物学功能奠定基础。结合同源克隆与半定量RT-PCR的方法,克隆得到甘蓝型油菜湘油15 LPAT5的1条全长1 041 bp的CDs序列,并命名为BnLPAT5。序列分析表明,它具有LPLAT_LCLAT1样结构域,属于LPLAT超基因家族。时空表达分析表明,BnLPAT5在根中的表达量最高,是茎和胚的2倍。逆境分析表明,BnLPAT5在NaCl、PEG4000、水渍、6BA和ABA的胁迫下呈现2种不同的表达模式,他们均对BnLPAT5基因的表达具有抑制作用。在NaCl、PEG4000及水渍处理下,BnLPAT5呈"骤降...

为探索甘蓝（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｌ．）在各种非生物逆境条件下Ｎａｃ转录因子的表达，以＂中甘１１号＂为材料，克隆获得甘蓝Ｎａｃ转录因子ＢｏＮａｃ２基因的ｃＤＮａ全长序列。序列分析表明，该ｃＤＮａ片段全长为１ ００２Ｂｐ，编码３３３个氨基酸，具有典型的Ｎａｃ类蛋白的结构特征。进化树分析表明，该蛋白属于ｓｅＮＵ５亚族，并与甘蓝型油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ＮａｐＵｓ ｌ．）ＢＮＮａｃ亲缘关系最近。亚细胞定位显示，ＢｏＮａｃ２蛋白分布于细胞核中。ｑｒＴ－ｐｃｒ分析表明，ＢｏＮａｃ２基因受ｐｅＧ和Ｎａｃｌ诱导表达。

【目的】克隆甘蓝型油菜(Brassica napus L.)矮化突变体"NDF-1"和野生型近等基因系亲本"3529"中ADP-核糖基化因子(ADP-ribosylation factor,ARF)基因全长cDNA,分析矮化突变体中该基因在不同组织中的表达水平,探讨矮化突变体中该基因在甘蓝型油菜茎杆发育过程中的作用。【方法】采用SSH(suppression subtractive hybridization)、RACE(rapid-amplification of cDNA ends)和RT-PCR技术,克隆甘蓝型油菜矮化突变体"NDF-1"和野生型"3529"中的ARF基因的全长cDNA序...

为了明晰球茎甘蓝MYB62转录因子的序列特征及其在逆境胁迫后的表达特征，进一步探索球茎甘蓝MYB62转录因子的生物学功能，为后续MYB62转录因子功能鉴定提供理论依据，以球茎甘蓝为研究对象，采用同源克隆的方法获得球茎甘蓝MYB62转录因子基因，并对其进行生物信息学分析，通过实时荧光定量PCR的方法分析MYB62在球茎甘蓝不同组织间以及逆境胁迫后的表达特征。基因克隆结果表明，BocMYB62基因gDNA全长1 353 bp, CDS为837 bp,包括4个外显子和3个内含子，编码278个氨基酸。序列结构分析结果显示，BocMYB62为亲水性蛋白，具有2个SANT-MYB结构域，属于R2R3-MYB型MYB转录因子；空间结构预测显示其具有典型的α-螺旋结构；系统发育分析表明，BocMYB62与甘蓝型油菜MYB62亲缘关系最近。时空表达结果显示，BocMYB62在绿色球茎甘蓝中的表达量始终高于在紫色球茎甘蓝中，且存在明显的组织特异性，在干旱胁迫后BocMYB62表达量显著升高，胁迫12 h表达量最高，低温胁迫后BocMYB62表达量显著低于对照，在4℃低温胁迫时表达量最低，推断BocMYB62可能参与花青素生物合成调控，并可能参与逆境胁迫的调控作用。

【目的】克隆特早熟春性甘蓝型油菜Ａ基因组上的ｓＢｎＦＬＤ基因，并对其进行表达研究，为该基因的功能及其在成花转变中的作用研究奠定基础。【方法】根据ＧｅｎＢＡｎｋ中已报道的拟南芥和白菜型油菜ＦＬＤ同源基因的保守序列设计引物，采用ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ扩增特早熟春性甘蓝型油菜８６号品系（光周期不敏感）的ＦＬＤ同源基因，用ｑＲＴ－ＰＣＲ技术检测ｓＢｎＦＬＤ基因在８６号品系不同发育时期茎、叶和茎尖中的表达情况。【结果】克隆出了ｓＢｎＦＬＤ基因，命名为ｓＢｎＦＬＤ，在ＧｅｎＢＡｎｋ中的登录号为ｋＲ００３０７９．１。ｓＢｎＦＬＤ基因ＣＤｎＡ全长２ ３７６ＢＰ，有３个内含子，４个外显子，编码７９１个氨基酸残基，．．．

【目的】克隆甘蓝型油菜(Brassica napus)油体钙蛋白(caleosin)基因BnClo1,并进行原核表达研究。【方法】在获得甘蓝型油菜BnClo1基因全长cDNA的基础上,根据BnClo1基因编码区设计1对特异引物,以甘蓝型油菜种子总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约750bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pTYB12中,构建融合表达载体pTYB12-BnClo1,转化到Escherichia coli ER2566(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长768bp,包含完整的开放阅读...

通过RT-PCR、同源克隆和RACE等方法由甘蓝总RNA扩增得到了甘蓝脯氨酸脱氢酶基因cDNA全长(1 719 bp),其中包含了一个1 497 bp的完整开放阅读框,编码498个氨基酸,与已发表的十字花科植物ProDH基因均具有85%以上的同源性。在此基础上设计并克隆干扰片段,利用酶切连接的方法将该基因干扰片段正反向插入到载体pFGC-1008的GUS内含子两侧,经限制性内切酶酶切和测序鉴定,证明植物表达载体pFGC-gPDH已构建成功,为进一步研究该基因的功能创造了条件。

丙酮酸羧化酶(PEP)是控制油菜蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶,抑制种子中pepc基因的表达,使其底物(丙酮酸)更多地朝生成油脂的方向流动,对提高种子的含油量,增加油菜的经济价值具有重要的意义.利用PCR技术从甘蓝型油菜湘油15号基因组中扩增了PEP基因片段,并将其克隆到pGEM-TEasy载体上进行测序.测序结果表明:扩增片段长576bp,与Yannai报道的PEP基因相应区域的同源性为95%.用扩增引物上设计的BamHI和SacI两位点酶将PEP基因片段切下,反向插入到pBI121.N质粒的Napin启动子之后,构建了种子特异性反义PEP表达载体,并通过农杆菌介导法将反义PEP基因转化到...

【目的】克隆特早熟春性甘蓝型油菜的ＦＣＡ同源基因（ｓＢｎＦＣＡ）及其可变剪接体，并分析该基因的表达模式。【方法】根据拟南芥和芸薹属植物ＦＣＡ基因的ＤｎＡ序列和ＣＤｎＡ序列设计引物，用ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆特早熟春性甘蓝型油菜＂８６号＂的ＦＣＡ同源基因（ｓＢｎＦＣＡ）及其可变剪接体，对克隆基因及编码蛋白序列进行生物信息学分析，构建系统进化树，并用ｑＲＴ－ＰＣＲ技术检测ｓＢｎＦＣＡ基因在不同发育时期根、茎、叶、茎尖中的表达量。【结果】克隆出了ｓＢｎＦＣＡ基因的全长序列（８ ８２７ＢＰ），得到了ｓＢｎＦＣＡ－γ可变剪接体及一个新的可变剪接体（ｓＢｎＦＣＡ－５），新的可变剪接体在ＧｅｎＢＡｎｋ中．．．

为了探究菘蓝IiCYP79B2基因的结构、特性和功能,对菘蓝IiCYP79B2基因进行了克隆,并进一步开展了生物信息学分析和不同条件下的表达模式研究。相关研究结果显示:IiCYP79B2基因全长1 827 bp,包含1个内含子,ORF全长1 629 bp,编码542个氨基酸。其编码的蛋白含有2个跨膜结构域,无信号肽,定位于叶绿体类囊体膜上,属于主要由无规则卷曲和α-螺旋构成的亲水性蛋白,与白芥的亲缘关系最近。qRT-PCR分析结果表明:IiCYP79B2基因在菘蓝各组织中的表达量由高到低依次为叶>茎>果>花>根,在不同发育时期的表达量依次为营养生长期>花期>幼苗期>萌芽期;此外,该基因的表达还显著响应茉莉酸甲酯(MJ)和葡萄糖(Glu)信号的诱导,受到水杨酸(SA)和低温(Cold)胁迫的抑制。相关研究结果为进一步探讨IiCYP79B2基因的功能提供了有效的试验依据。