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[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
李东昊 姜玲 刘春林 阮颖
以甘蓝型油菜‘湘油15号’为试材,通过生物信息学分析,运用CRISPR/Cas9系统对Bna SDG8第1个外显子上的Bna SDG8–A和Bna SDG8–C保守序列区域进行CRISPR/Cas9敲除位点设计,构建了CRISPR/Cas9敲除载体p CAMBIA1300–sg RNA/Cas9–Bna SDG8;通过遗传转化,获得转化植株19株;经测序比对,4株植株的Bna SDG8被成功编辑;通过对定向敲除植株开花时间的统计分析,初步确定Bna SDG8参与甘蓝型油菜开花时间的调控。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
许磊 何菡子 范楚川
油菜是世界第二大油料作物，同时也是我国最主要的食用植物油来源。长期以来，油菜育种工作者尝试通过传统育种策略培育良种。然而，甘蓝型油菜是种间杂交后双二倍进化而来的异源四倍体物种，其基因组中存在较多基因冗余现象。因此，通过人工杂交选择、随机诱变等传统遗传方法改良性状效率非常低。近年来，CRISPR/Cas9技术以其高效、简便的独特优势，已广泛应用于多倍体油菜的基因功能研究和定向遗传改良。为了能够快速高效地对甘蓝型油菜进行种质资源创新和遗传改良，将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于甘蓝型油菜恰逢其时。本文综述了目前CRISPR/Cas9系统应用于油菜基因功能研究和遗传改良的研究进展，涉及油菜产量、含油量和脂肪酸组成、生物和非生物胁迫耐受性等重要农艺性状，并探讨了油菜基因编辑存在的局限性以及未来发展的方向。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
陶英杰 刘凤娟 毕春晓 任雪冰 曲瑞红 李科友 徐全乐
【目的】克隆山黧豆β-腈基丙氨酸合成酶基因（CASase）DNA全长序列，构建CRISPR/Cas9敲除载体，为筛选“低毒、高硫”山黧豆品系奠定基础。【方法】以萌发4 d山黧豆幼苗根部为材料，提取其基因组DNA，利用PCR克隆CASase基因全长；经序列同源性、内含子、外显子、sgRNA靶位点和脱靶分析后，在CASase cDNA上选取5个sgRNA靶位点进行寡核苷酸链设计和体外活性检测；从5个sgRNA靶位点中取活性较高的4个sgRNA，利用酶切连接法构建基因敲除载体pPLHACas9-sgRNA20r
[期刊] 西南农业学报
[作者]
赵凯琴 罗延青 俎峰 王敬乔 李劲峰 陈苇 张云云 杨清辉
【目的】通过表达外源GlgC基因增加甘蓝型油菜种子淀粉积累,从而可能增加含油量,为油菜高含油量育种提供一种潜在的新途径。【方法】本研究将定点突变的大肠杆菌AGPase基因GlgC分别和2个种子特异表达启动子DOF(拟南芥球形胚阶段启动子)、Cruc(油菜种子特异蛋白启动子)重组,构建2个GlgC过表达载体pMB-DOF-TG和pMB-Cruc-TG。利用农杆菌介导法转化甘蓝型油菜,获得转基因植株。【结果】PCR及半定量RT-PCR检测结果显示,GlgC基因已导入油菜再生植株基因组并获得表达。【结论】获得了甘蓝型油菜转GlgC基因阳性株,为利用遗传改良技术实现上述途径在油菜育种中的应用奠定前期基础。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
李兰玉 陈苇 杨清辉 罗延青 董云松 李根泽 王敬乔
利用甘蓝型油菜‘Wester’的cruciferin启动子及NOS终止子构建了无选择标记基因且含有反义结构的油酸脱饱和酶基因(Fad2)的RNAi表达载体.通过农杆菌介导法,获得了无选择标记转基因植株;再生植株的PCR检测表明,外源基因已高频率地整合到油菜基因组中.
[期刊] 华北农学报
[作者]
韩政宏 段宇轩 徐善斌 王敬国 刘化龙 杨洛淼 贾琰 辛威 郑洪亮 邹德堂
为促进长粒型粳稻品种的选育，以粳稻品种东富139、龙粳31和东农427为试验材料，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了pYLCRISPR/Cas9-GS3-RNA和pYLCRISPR/Cas9-GS3-GS9-RNA 2个敲除载体，通过农杆菌转化法侵染受体材料的愈伤组织，对GS3和GS9基因进行定点编辑。最终，3个品种在T_2都获得了GS3单基因突变、GS9单基因突变和GS3、GS9双基因突变，且无T-DNA元件的纯合植株。在成熟期对T_2突变体及其野生型的农艺性状进行考察分析，结果表明，与野生型相比，3个品种的gs3突变植株的粒长、千粒质量均显著增加，粒宽、结实率和穗粒数无显著变化；gs9突变体粒长显著增加，粒宽显著减少，千粒质量、结实率和穗粒数无显著变化；gs3gs9突变体粒长增加，且增幅大于gs3和gs9,同时粒宽显著减少，千粒质量显著增加，而结实率和穗粒数无显著变化。综上，利用CRISPR/Cas9技术对东富139、龙粳31和东农427等3个粳稻品种的粒型进行改良，加快了长粒型粳稻新品种的选育进程。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
彭梅芳 甘凤 潘春梅 宋健兰 范晓丽 陈克贵
【目的】在植物转基因研究中,使用选择标记基因(Selectable Marker Gene, SMG)使得转化子的筛选更准确便利,但存在SMG的转基因植株可能对人类健康及生态环境造成潜在危害,这也限制了转基因植物商业化的应用前景。因此去除转基因植物中的SMG十分必要。【方法】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对水稻转基因中常用的SMG潮霉素抗性基因(hygromycin phosphotransferase II,hptII)设计构建了编辑载体,利用农杆菌(LBA4404)介导的遗传转化方法转化水稻日本晴,得到转化植株,再将转化植株与带有hptII基因的植株进行杂交。【结果】通过遗传转化及分子鉴定,本研究得到了18株可用于编辑hptII基因的转化植株,进一步对转化植株与带有hptII基因的植株杂交的F_1代进行检测,经PCR检测及测序验证表明,在杂交F_1代植株中,hptII基因的DNA确有编辑发生,包括碱基缺失、替换以及插入等,使得hptII基因不能成功转录。【结论】利用CRISPR/Cas9技术,成功获得了删除hptII基因的转基因水稻。这为植物转基因研究实现无选择标记基因(marker-free)奠定了基础。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
赵凯琴 罗延青 王敬乔 俎峰 陈苇 李劲峰
ＡＤＰ－葡萄糖焦磷酸化酶（ＡＧＰＡｓｅ）是淀粉合成途径的关键酶。本研究克隆了大肠杆菌ＡＧＰＡｓｅ基因ＧｌＧ Ｃ，并通过双定点突变降低其对无机磷酸盐敏感性所致抑制作用以提高其酶活。而后将甘蓝型油菜ＡＧＰＡｓｅ导肽编码序列与ＧｌＧＣ融合，构建成植物表达载体Ｐ ＭＢ－ＴＧ，并导入根癌农杆菌ｌＢ４４０４。利用农杆菌介导法转化甘蓝型油菜，获得转基因植株。ＰＣＲ及半定量ＲＴ－ＰＣＲ检测结果显示，该融合基因已导入油菜再生植株基因组并获得表达。增加淀粉积累为油脂合成提供更多碳源，被认为是一条潜在的提高油菜种子含油量的有效途径。本研究为利用遗传改良技术实现上述途径在油菜育种中的应用奠定前期基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
丁勇 常玮 刘小烛
【目的】克隆甘蓝型油菜(Brassica napus)油体钙蛋白(caleosin)基因BnClo1,并进行原核表达研究。【方法】在获得甘蓝型油菜BnClo1基因全长cDNA的基础上,根据BnClo1基因编码区设计1对特异引物,以甘蓝型油菜种子总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约750bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pTYB12中,构建融合表达载体pTYB12-BnClo1,转化到Escherichia coli ER2566(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长768bp,包含完整的开放阅读...
[期刊] 华北农学报
[作者]
邢蔓 谭太龙 李健 邬贤梦 官春云 熊兴华
为提高油菜含油量，构建了基于油菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（ＰＥＰＣ）的ｉｈＰＲＮＡ植物表达载体。分别从甘蓝型油菜基因组中克隆了种子储藏蛋白ＮＡＰｉＮ基因启动子（３１５ ｂＰ）、ＰＥＰＣ基因的外显子片段（２４６ ｂＰ）及ＰＥＰＣ基因的内含子（７５４ ｂＰ），包含了其剪切位点之前４ ｂＰ和之后１８ ｂＰ片段。通过中间载体ＰｂｌｕＥｓＣＲｉＰｔⅡｓＫ（＋）再构建到Ｐｂｉ１２１中，构成种子特异表达的内含子剪接的ＰＥＰＣ基因的ＲＮＡ干扰载体Ｐ ｂｉ１２１．ＮＰ＋ｉＰ－。利用农杆菌介导法对湘油１５号进行遗传转化，获得卡那霉素抗性转化植株９株，ＰＣＲ检测证实外源片段成功导入其中７株油菜基因组中。对ｔ２种子．．．
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张志刚 白德朗 陈烈臣 熊兴华 李栒 官春云
丙酮酸羧化酶(PEP)是控制油菜蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶,抑制种子中pepc基因的表达,使其底物(丙酮酸)更多地朝生成油脂的方向流动,对提高种子的含油量,增加油菜的经济价值具有重要的意义.利用PCR技术从甘蓝型油菜湘油15号基因组中扩增了PEP基因片段,并将其克隆到pGEM-TEasy载体上进行测序.测序结果表明:扩增片段长576bp,与Yannai报道的PEP基因相应区域的同源性为95%.用扩增引物上设计的BamHI和SacI两位点酶将PEP基因片段切下,反向插入到pBI121.N质粒的Napin启动子之后,构建了种子特异性反义PEP表达载体,并通过农杆菌介导法将反义PEP基因转化到...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
赵凯琴 罗延青 王敬乔 俎峰 陈苇 李劲峰
ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)是淀粉合成途径的关键酶。本研究克隆了大肠杆菌AGPase基因glg C,并通过双定点突变降低其对无机磷酸盐敏感性所致抑制作用以提高其酶活。而后将甘蓝型油菜AGPase导肽编码序列与glgc融合,构建成植物表达载体p MB-TG,并导入根癌农杆菌LB4404。利用农杆菌介导法转化甘蓝型油菜,获得转基因植株。PCR及半定量RT-PCR检测结果显示,该融合基因已导入油菜再生植株基因组并获得表达。增加淀粉积累为油脂合成提供更多碳源,被认为是一条潜在的提高油菜种子含油量的有效途径。本研究为利用遗传改良技术实现上述途径在油菜育种中的应用奠定前期基础。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
唐国盘 黄安群 孙志鹏 匡友谊 王胜杰 王大伟
比较三种常用的CRISPR/Cas9基因敲除检测变异方法,从准确性、耗时、成本和应用限制等方面进行评估。采用T7核酸内切酶I、限制性内切酶和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分别对利用CRISPR/Cas9方法敲除的fibinb和ngs基因的50尾斑马鱼(Danio rerio)突变纯合个体和突变杂合个体进行检测,用野生型个体作对照;同时用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对CRISPR/Cas9方法敲除的ogn和ddb1基因的突变杂合个体进行了检测。结果表明:三种方法均能够区分突变杂合个体,其中T7核酸内切酶I检测法耗时最短,但该方法不能用于鉴定突变纯合个体;限制性内切酶检测法能够用于鉴定纯合个体,但需要有特异性的识别位点;非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法能够区分纯合和杂合个体,对序列无依赖性,能够检测出序列中存在的所有变异。成本上,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法最经济;限制性内切酶的价格存在较大的差异,因此检测成本依赖于酶的价格。三种检测方法各有优缺点,在应用实践中可根据试验需要选择合适的方法。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
李兰玉 陈苇 杨清辉 罗延青 符明联 董云松 李根泽 王敬乔
利用甘蓝型油菜种子特异性贮存蛋白基因cruciferin启动子及NOS终止子构建了无选择标记基因且含有反义结构的油酸脱饱和酶基因(Fad2)的RNA i表达载体。通过农杆菌介导法,获得了无选择标记转基因植株;再生植株的PCR检测表明,外源基因已高频率地整合到油菜基因组中,而且获得的转基因种子通过脂肪酸含量分析表明,油酸含量比对照有了很大的提高。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
戴晓峰 卢长明 吴刚 武玉花 肖玲
【目的】生物素羧基载体蛋白负责将羧基从生物素羧化酶转移到羧基转移酶上,对于长链脂肪酸的从头合成与种子含油量的形成具有十分重要的作用。本研究的目的是从甘蓝型油菜品种基因组DNA中分离生物素羧基载体蛋白(BCCP)基因的全长编码区序列,通过生物信息学分析揭示该基因的结构特征(包括内含子的数量、长度与分布,蛋白质保守区疏水性特征等)和功能关系。【方法】基因克隆采取同源序列法进行。【结果】分离得到的bccp基因全长均为1600bp左右,根据其结构特点可以分成3种类型,它们均包含5个内含子。bccp1基因编码的蛋白质具备完整的生物素化功能结构域,是唯一功能完整的基因序列;bccp2和bccp3由于移码突...
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