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[期刊] 华北农学报
[作者]
王飞 钟雄辉 陈登辉 李海龙 康俊根 颉建明
为研究甘露醇浓度、酶解时间、离心力大小和不同外植体对原生质体产量和活力的影响,采用正交试验方案对甘蓝原生质体制备体系进行了优化,并建立了甘蓝原生质体的瞬时转化体系,同时利用该体系对甘蓝CRISPR/Cas9基因编辑系统进行了初步研究。结果表明:以下胚轴为材料,酶液组成为1%纤维素酶+0.5%离析酶+0.6 mol/L甘露醇+10 mmol/L MES+1 mmol/L CaCl_2+0.1%BSA+5 mmol/Lβ-巯基乙醇,26℃,60 r/min,黑暗酶解6 h后,用2 115 r/min离心5 min收集细胞,可获得高质量的原生质体,原生质体产量约为3.0×10~6个/g,活力约为90.9%;另外,在20%PEG4000介导下,将带有绿色荧光蛋白的载体(PYBA 1132)分别转入从甘蓝下胚轴、子叶、叶球分离获得的原生质体中,在荧光显微镜下观察到GFP绿色荧光信号,转化效率分别为43%,35%,19%,表明下胚轴分离获得的原生质体最适于瞬时转化。同时以下胚轴分离获得的原生质体为受体,分别转化线粒体特异表达载体COX和质体特异表达载体969,也观察到了荧光信号,成功建立了甘蓝原生质体瞬时转化体系,为甘蓝功能基因定位与功能分析提供了技术平台。最后,利用该体系对CRISPR/Cas9基因编辑载体(PBSE401-BoPDS)中sgRNA的靶向编辑能力进行了检测,结果显示,靶点1和靶点2附近的序列中有碱基替换和插入,表明该体系能够应用于甘蓝瞬时基因编辑,为甘蓝基因功能研究以及新种质的创制建立了重要的技术平台。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
贺涵 阳习鹏 赵婉欣 邵雪花 杨凤玺 刘传和
【目的】研究菠萝叶基原生质体的高效分离方法,并对制备的原生质体进行瞬时转化,为利用菠萝原生质体进行菠萝基因功能研究提供技术支持。【方法】以‘巴厘’菠萝(Ananas comosus,‘Comtede Paris’)幼嫩叶片的叶基为材料,采用3因素3水平正交试验L9(33)分析纤维素酶质量浓度(6,12,20 g/L)、离析酶质量浓度(3,6,9g/L)和甘露醇浓度(0.4,0.5,0.6 mol/L)对分离原生质体产量与活力的影响;同时,利用单因素试验(设置酶解时间2,4,6 h)筛选制备原生质体的最适酶解时间,确定分离菠萝叶基原生质体的最适条件;在最适条件下制备原生质体,采用聚乙二醇(PEG)介导法转化质粒,建立菠萝原生质体瞬时转化体系。【结果】L_9(3~3)正交试验结果显示,不同处理分离的原生质体产量为1.01×10~6～1.93×10~6 g~(-1),纤维素酶质量浓度是决定原生质体产量的关键因素;原生质体活力为65.55%～87.00%,甘露醇浓度对原生质体活力的贡献最大。最适酶解条件为:菠萝叶基在含12 g/L纤维素酶、6 g/L离析酶、0.6 mol/L甘露醇的酶液中避光酶解4 h,产量可达1.96×10~6 g~(-1),活力为85.54%。菠萝叶基原生质体通过PEG介导法转化p AN580-WRKY75质粒后,可在激光共聚焦显微镜下观察到核内的绿色荧光信号。【结论】确定了菠萝叶基原生质体的最适分离条件与瞬时转化方法,建立了适用于菠萝基因功能分析的原生质体瞬时表达体系。
[期刊] 林业科学
[作者]
谷战英 杨若楠 陈昊
【目的】探索油桐叶肉细胞原生质体分离的最适条件,建立油桐原生质体的遗传转化体系,使在油桐体内研究自身基因的功能成为可能。【方法】以油桐成熟叶片和组培苗幼叶为材料,通过酶解法成功分离得到油桐叶肉细胞的原生质体并确定最适分离条件。在此基础上,以获得的原生质体为受体系统,建立PEG介导的油桐原生质体基因转化方法。【结果】原生质体分离结果表明,酶解时间对原生质体产量和活性的影响最大,其次是纤维素酶浓度,而离析酶浓度和甘露醇浓度对原生质体产量和活性的影响较小。以成熟叶片为材料分离原生质体的最适条件为纤维素酶浓度1.
关键词：
油桐 原生质体制备 遗传转化 亚细胞定位
[期刊] 华北农学报
[作者]
陈云 于一帆 潘淑芬 周研 葛会敏 刘立军
为建立甘蓝型油菜异三聚体Ｇ蛋白各组分原生质体瞬时表达体系，以油菜叶片为试材，从试材选取、平摇时间和聚乙二醇浓度方面优化了油菜原生质体制备条件和转化条件。结果表明，选取３０ ｄ苗龄叶片、平摇１０ ｍｉｎ时原生质体游离状态最佳，产量为１０．７３×１０～６／ｍ Ｌ，活力可达９６．４％。采用３０％ＰＥＧ转化原生质体时，目的蛋白表达量最高。ＷＥｓｔＥｒｎ ＢｏＬｔ的检测分析表明，异三聚体Ｇ蛋白各组分均参与了甘蓝型油菜对ＡＢＡ的应答反应，当ＡＢＡ浓度分别为１００，１５０，１００，５０ ｍｍｏＬ／Ｌ时，Ｂｎ ＧＡ１、Ｂｎ ＧＢ１、Ｂｎ ＧＧ２和ＢｎｒＧｓ１蛋白的表达量最高。
关键词：
油菜 原生质体瞬时表达 异三聚体G蛋白
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
张娅 刘晓烽 张婧 何弦 袁媛 吕美玲 黄晨星 郑祥梓 缪颖 伍炳华
探索了茉莉花原生质体瞬时转化的方法,发现室外种植盛开的茉莉花花瓣更适于分离有活力的原生质体,在15 g·L~(-1)纤维素酶、8 g·L~(-1)果胶酶和4 g·L~(-1)离析酶共同作用下,于25℃黑暗条件酶解5 h,所获得的原生质体产量和活性最佳.当细胞浓度为4×10~5个·mL~(-1),外源质粒DNA含量为75μg·mL~(-1)原生质体时,在200 g·L~(-1)的PEG-4000介导转化2～10 min,可获得较高的转化效率.利用本研究建立的茉莉花原生质体瞬时转化体系成功鉴定了3个茉莉花来源蛋白的亚细胞定位,为高通量开展茉莉花关键基因的功能研究提供了技术支持.
关键词：
茉莉花 原生质体 亚细胞定位
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李青 鱼海鹏 张子豪 孙正文 张艳 张冬梅 王省芬 马峙英 阎媛媛
【目的】真叶细胞能模拟植物内源条件,建立基于棉花真叶原生质体的高效瞬时表达体系,为快速有效研究棉花基因功能提供方法。【方法】以陆地棉TM-1真叶为材料,采用常用的纤维素酶和离析酶组合分离原生质体,探究影响原生质体分离的叶龄、渗透压、酶解液成分和酶解时间,及渗透压和酶解时间对原生质体活力的影响,并分析渗透压、PEG浓度和培养液种类对原生质体瞬时转化的影响,进而优化棉花真叶原生质体瞬时表达体系。构建GhLTP-GFP表达载体,对比融合蛋白在拟南芥、棉花原生质体和烟草表皮细胞中的亚细胞定位,验证该体系。【结果】不同于棉花子叶,酶解液中高浓度CaCl_2会显著抑制真叶细胞壁的酶解,含10 mmol·L~(-1) CaCl_2的酶解液能有效分离棉花真叶原生质体。甘露醇显著影响原生质体得率,含0.5 mol·L~(-1)甘露醇的酶解液分离原生质体得率最高,且细胞形态维持较好,而0.4 mol·L~(-1)甘露醇条件下原生质体活力降低一倍,表明0.5 mol·L~(-1)甘露醇能较好维持棉花真叶原生质体渗透压。陆地棉刚展平的真叶分离所得原生质体大小合适,而展平后的嫩叶分离得到的原生质体细胞较大,得率降低一倍。酶解处理7 h前,原生质体游离缓慢,酶解9 h原生质体产量达到高峰,继续酶解原生质体将破裂,得率降低。在等渗条件下用40%PEG4000转化所得原生质体,转化效率最高,而普遍采用的低渗条件不利于棉花真叶原生质体的转化。转化后,用WI溶液继续培养原生质体,会引起原生质体的大量破裂,用含0.5 mol·L~(-1)甘露醇的W5溶液继续培养,有利于原生质体形态的维持,转化率提高到90%。表达载体35S:GhLTP-GFP分别转入棉花、拟南芥原生质体和烟草表皮细胞,GFP信号在细胞中的定位结果一致。【结论】建立的棉花真叶原生质体瞬时表达体系,可获得8.10×10~6个/mL活力在95%以上的高质量原生质体,原生质体得率提高8倍,转化效率达到90%,可用于亚细胞定位、蛋白互作,以及代谢调控网络研究等。
关键词：
棉花 TM-1 原生质体分离 瞬时表达
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
吴元华 董雪 安梦楠 苏燕妮 李晓冬
植物原生质体是除去细胞壁后仍具有活力的裸露单细胞,其在植物RNA病毒的复制机理研究方面具有广泛的应用。为了获得高产、高活力的烟草原生质体,以烟草(Nicotiana tabacum Linn.)品种K326为材料,对原生质体制备体系中的不同细胞壁酶解液成分、酶解时间、酶解渗透压稳定剂含量、离心时间以及离心转速等因素进行优化。结果表明:在含1%纤维素酶,0.5%离析酶,0.6mol·L-1甘露醇的酶解液中,26℃慢速震荡(40r·min-1)酶解4h,700r·min-1离心3min,得到产量及活力较高的原生质体,可直接用于植物病毒的接种试验;利用聚乙二醇(PEG)融合法向获得的高活力原生质体中...
[期刊] 林业科学研究
[作者]
邢俊霞 臧巧路 叶查龙 张陈谊 程冬霞 齐力旺 杨玲 李万峰
[目的]优化农杆菌介导的日本落叶松胚性愈伤组织瞬时转化体系。[方法]以液体增殖培养7 d的日本落叶松胚性愈伤组织为受体材料，利用携带β-葡糖醛酸酶基因（GUS）的pCAMBIA1305.1载体进行瞬时转化，根据GUS的表达量及酶活性，筛选最佳侵染液浓度、侵染时间和共培养时间。并利用筛选出的转化体系，分析落叶松scarecrow-like 6(LaSCL6)启动子的活性。[结果]瞬时转化后，GUS表达明显。当侵染液浓度OD_(600)为0.2，侵染5 min，共培养72 h时，GUS的表达量最高，△C_T值为-2.274 2；当侵染液浓度OD_(600)为0.05，侵染5 min，共培养72 h时，GUS酶活性最高，为25.728 6 U·L~(-1)。LaSCL6启动子的活性是CaMV35S启动子的1.55倍。[结论]综合考虑GUS的表达量和酶活性，当侵染液浓度OD_(600)为0.05，侵染5 min，共培养24 h时，GUS的表达量和酶活性较高，这一条件可以用来进行日本落叶松胚性愈伤组织的高效转化。
[期刊] 华北农学报
[作者]
杜晓敏 王均 安子玄 裴丹 王华忠
为建立一套稳定高效的小麦叶肉细胞原生质体制备技术流程，以小麦幼苗叶片为材料，采用正交和随机设计试验分析了影响小麦叶肉细胞原生质体产量的制备因素。结果发现，酶解条件相关因素对制备原生质体产量的影响由大到小依次为酶解液甘露醇浓度、纤维素酶浓度、酶解时间和离析酶浓度；甘露醇浓度和纤维素酶浓度对原生质体产量的增长表现相互促进模式，延长酶解时间情况下低纤维素酶浓度产出的原生质体较高纤维素酶浓度破碎情况少，峰值过后的产量下降慢。研究还发现取材幼苗苗龄、光照条件和取材叶位等因素对原生质体产量也有影响。综合以上结果确定了一套优化的参数组合：以黑暗培养条件下的１０ ｄ苗龄小麦幼苗第２片真叶为材料，酶解液中的纤维．．．
关键词：
小麦 原生质体 基因转化 瞬时表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘洁茹 冯露 林启芳 周杨 池秀凤 蔡明 程堂仁 王佳 张启翔 潘会堂
[目的]研究紫薇叶片原生质体的分离方法,并对制备的原生质体进行瞬时转化,为紫薇本源物种的基因功能分析提供技术支持。[方法]以F_1株系S047(以屋久岛紫薇(L.fauriei)为母本、紫薇品种‘Pocomoke’为父本杂交获得)及‘Ebony Embers’和‘Pocomoke’3个紫薇品种幼嫩叶片为材料,对其进行酶解,筛选最适紫薇品种,在此基础上,采用单因素试验初步筛选纤维素酶、离析酶质量浓度(5,10,15,20,25,30 g/L)及甘露醇浓度(0.4,0.6,0.8mol/L),之后采用3因素3水平正交试验筛选纤维素酶(10,20,30 g/L)、离析酶(3,5,7 g/L)和果胶酶(2,4,6 g/L)的最适质量浓度,确定分离紫薇原生质体的最优条件。用聚乙二醇(PEG)介导法将质粒pSuper1300::GFP转化紫薇原生质体。[结果]分离原生质体的最适紫薇品种为S047株系,其在酶解过程中无褐化现象,分离液呈明亮绿色,可得到完整的原生质体;其他2个品种未分离到原生质体。单因素试验结果显示,最适的纤维素酶质量浓度为15～20 g/L,离析酶质量浓度为5～10 g/L,甘露醇浓度为0.6 mol/L。正交试验结果表明,10 g/L纤维素酶、5 g/L离析酶、4 g/L果胶酶和0.6 mol/L甘露醇混合液为最佳酶解溶液,在黑暗条件下酶解紫薇幼嫩叶片5 h,可成功分离出紫薇原生质体,其产量达28×10~5 g~(-1),破损率为14%。将纯化的原生质体进行PEG介导的转化后,在激光共聚焦荧光显微镜下观察到绿色荧光信号,表明基因转化成功。[结论]获得了紫薇叶片原生质体分离体系,并成功进行了基因瞬时转化。
关键词：
紫薇 酶解法 叶片原生质体 瞬时转化
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
许静 单亚楠 何豆 陈淞渝 庄炜 王爱荣
通过生物信息学鉴定了油菜中的突触融合蛋白BnSYP122,其由一个N端syntaxin结构域、一个典型的SNARE基序及一个C端跨膜结构域组成,并且N端结构域包含被称为Ha、Hb、Hc基序的3个α-螺旋束.进一步利用Gateway技术成功将目的蛋白构建于植物表达载体pEarleyGate 104上,与带有绿色荧光蛋白的pEGAD分别转化农杆菌GV3101菌株,采用农杆菌介导的真空渗透法在油菜叶片中进行瞬时表达.经激光共聚焦显微镜观察和Western blot检测表明,农杆菌介导的真空渗透法能够在油菜叶片中成功表达目的蛋白,同时验证了BnSYP122定位在细胞膜上.
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
邓叶 阳淑金 杜新平 董彬 任丽萍 房伟民 陈发棣 蒋甲福
[目的]本试验的目的是通过瞬时转化解决菊花转基因中存在的两大难题:转化效率低和表达水平低。[方法]通过农杆菌注射渗透法将含有GUS基因(编码β-葡糖苷酸酶)的表达载体pORE R1-2×35S∷GUS转入菊花‘优香’叶片中,进行瞬时表达,并组织培养转化后的叶片,利用GUS化学染色法和RT-PCR进行转化植株鉴定。[结果]菊花‘优香’瞬时表达的转化效率高达76.7%,外源基因(GUS)的表达水平也较理想,尤以第4和第5片完全展开叶(从形态学上端向形态学下端数)表现最佳。经过34个月的组织培养和抗性筛选,瞬时
关键词：
菊花 农杆菌侵染 瞬时表达 GUS 再生
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
石淑稳 周永明 孙学成 张献龙
以甘蓝型油菜（ＢｒａｓｉｃａｎａｐｕｓＬ．）９５０６品系的下胚轴为受体，用根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）介导，进行了除草剂Ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ抗性基因（ｐａｔ）的转化试验，得到了抗卡那霉素（Ｋａｎ）选择剂的小植株，并对影响转化的一些因素进行了研究。试验结果表明：Ｋａｎ和羧苄青霉素（Ｃｂ）对芽再生均具有很强的抑制作用；用含２，４－Ｄ的培养基对下胚轴进行预培养和选择培养基中附加ＡｇＮＯ３均能促进转化细胞的生长和芽的再生。转化植株对Ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ除草剂的抗性和分子验证工作正在进行中。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
万萌 王敬乔 寸守铣 邱仕芳 李根泽 曾黎琼 和江明
用携带ＴＡ２９—Ｂａｒｎａｓｅ雄性不育基因的农杆菌转化“双低”花培油菜，获得了大量转基因植株。用油菜的带柄子叶及下胚轴等外植体与携带载体质粒的农杆菌共培养后，将其转移到诱导愈伤组织及芽的培养基上培养，并同时进行卡那霉素的抗性筛选，２～４周后，在子叶柄基部及愈伤组织上出现小丛芽，将其切下转入Ｂ５加卡那霉素的培养基中进一步筛选并生根，再将生根的正常绿色植株移栽于花盆中。在五叶期，用５０ｍｇ／ｍ１的卡那霉素注射于真叶的叶脉中，进一步筛选，可得到完全正常的绿苗，说明卡那霉素抗性标记基因（ＮＰＴⅡ）已转入油菜植株，进一步的植株鉴定及分子生物学检测另文详述。
[期刊] 林业科学
[作者]
陈亮 孙庚午 王洪凯 吴树敬 林福呈 刘会香
葡萄座腔菌是木本植物溃疡类病害的重要病原,研究该病菌的侵染和致病过程有助于揭示病原与寄主的互作机制。携带gfp基因并高效表达的病菌可有效地实时检测和分析病菌的侵染过程,但由于该病菌在致病和室内培养过程中均不易产孢,因此,制备高质量的原生质体是进行gfp基因转化和表达的首要步骤。通过对酶的种类、酶解液浓度、菌丝年龄、酶解时间、酶解温度和渗透压稳定剂6个可能影响原生质体制备效率的参数进行分析,结果表明:原生质体最大产量产生的条件是菌龄42 h,以1.5%崩溃酶、1.5%葡聚糖在0.7 mol·L-1NaCl的渗透压稳定剂中酶解3.5 h,最适酶解温度31℃,制备的原生质体在酵母蛋白胨蔗糖培养基(Y...
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