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[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
申建梅 胡黎明 宾淑英 廖泓之 林进添
利用RT-PCR和RACE方法克隆获得瓜实蝇Bactrocera cucurbitae(Coquillett)普通气味结合蛋白(general odorant binding protein,GOBP)基因的cDNA全长序列,命名为BcucOBP。测序结果表明,BcucOBP开放阅读框全长447 bp,编码149个氨基酸。氨基酸序列比对及三维结构同源建模表明,此序列具有OBPs的典型特征,序列中具有6个保守的半胱氨酸和6个α螺旋区域。构建了重组表达载体pET28a(+)-BcucOBP,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在IPTG进...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张国辉 仵均祥
【目的】克隆梨小食心虫（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ ｍｏｌｅｓｔａ）普通气味结合蛋白２（ＧｍｏｌＧｏＢｐ２）的全长ｃＤＮａ序列并进行原核表达，为研究该蛋白在梨小食心虫化学感受系统中的作用奠定基础。【方法】利用ｒｔ－ｐｃｒ和ｒａｃｅ技术克隆ＧｍｏｌＧｏＢｐ２的全长ｃＤＮａ序列，并使用原核表达载体ｐｅｔ－３２ａ在大肠杆菌Ｂｌ２１（Ｄｅ３）中进行表达，用ｓＤｓｐａＧｅ和ＷｅｓｔｅｒＮ Ｂｌｏｔ检测其表达情况。【结果】ＧｍｏｌＧｏＢｐ２的ｃＤＮａ全长序列为６３７Ｂｐ（ＧｅＮＢａＮｋ登录号：ＪＮ８５７９４０），开放性阅读框长度为４８３Ｂｐ，编码１６１个氨基酸残基，成熟蛋白分子质量为１５．９８ｋｕ，等电点为４．．．．
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
金俊彦 张亚楠 杨科 高建清 董双林
针对重要农业害虫大螟,通过序列相似性分析从转录组数据获得2个普通气味结合蛋白(general odorant-binding protein,GOBP)基因cDNA片段,利用RACE技术进一步得到cDNA全长,分别命名为SinfGOBP1和SinfGOBP2。2个基因编码的氨基酸序列和已报道的昆虫同源序列具有较高的相似性,其中SinfGOBP1和黄地老虎、小地老虎的相似性最高,分别为91%和90%;SinfGOBP2和谷实夜蛾、甘蓝夜蛾的相似性最高,均为87%。进化分析表明,不同昆虫GOBP被明显分为GOBP1和GOBP2两个亚组,暗示2个亚组GOBP在功能上的分化;此外,相同亚组内GOBP基...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
金丰良 董小林 许小霞 任顺祥
【目的】克隆、序列分析和原核表达编码斜纹夜蛾(Spodoptera litura)GOBPⅠ(SlGOBPⅠ)的cDNA。【方法】采用同源克隆结合RACE的方法克隆SlGOBPⅠ基因的cDNA序列,并在pET-32a/BL21(DE3)系统中进行原核表达。【结果】从斜纹夜蛾触角中克隆了GOBPⅠ的cDNA序列(GenBank登录号为EU086372),序列分析表明,SlGOBPⅠ开放阅读框序列为495bp,编码164个氨基酸,分子量为19.3kD,等电点为5.54。SlGOBPⅠ具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即氨基酸序列中具有6个半胱氨酸残基,呈酸性。SlGOBPⅠ氨基酸序列与鳞翅目昆虫的气...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李玲 谭瑶 周晓榕 庞保平
【目的】沙葱萤叶甲(Galeruca daurica)是近年来在内蒙古草原上暴发成灾的新害虫,本文旨在克隆沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20的cDNA全长序列,明确其重组蛋白与寄主植物挥发物的结合特性,为揭示沙葱萤叶甲嗅觉的分子机理打下基础。【方法】基于沙葱萤叶甲转录组数据,利用RACE技术对沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20进行cDNA全长克隆;利用生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;通过原核表达系统表达目的蛋白,并使用Ni-NTA Agarose亲和层析柱进行重组蛋白纯化。最后采用荧光竞争结合的方法,以N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)为荧光探针,检测GdauOBP20重组蛋白与13种主要寄主挥发物的结合情况。【结果】GdauOBP20的cDNA全长序列为567 bp(GenBank登录号MK250532),其中5′末端非编码区长24 bp,3′末端非编码区长123 bp,具有ployA尾结构;开放阅读框(ORF)全长为420 bp,编码139个氨基酸。氨基酸序列中含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-C OBP亚家族。预测蛋白三级结构中含有6个α螺旋和两对由半胱氨酸形成的二硫键。成功构建了重组表达载体并获得了高纯度的重组蛋白。重组蛋白GdauOBP20与荧光探针1-NPN的结合常数为12.8μmol·L-1,结合能力较好,可作为本试验的荧光报告子。在所测的13种主要寄主植物挥发物中,除与二烯丙基三硫醚无结合能力外,GdauOBP20重组蛋白与其他12种寄主植物挥发物均有不同程度的结合能力,其中与对二甲苯和环庚三烯的结合能力最强,解离常数分别为22.91和26.55μmol·L-1,而与月桂烯结合能力最弱,解离常数为116.29μmol·L-1。【结论】沙葱萤叶甲GdauOBP20能与寄主植物的多种主要挥发性物质结合,推测其可能在沙葱萤叶甲对寄主植物的定位过程中发挥重要的作用。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李红亮 聂文敏 高其康 程家安
【目的】克隆、分析和原核表达编码中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2的cDNA。【方法】以13个不同日龄中华蜜蜂工蜂触角为材料,通过RT-PCR技术以获得编码中华蜜蜂Apis cerana cerana气味结合蛋白ASP2基因成熟蛋白开放阅读框序列,并在pET-30a(+)/BL21(DE3)系统中进行原核表达。【结果】克隆了命名为Acer-ASP2(GenBank登录号:DQ449667)的中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2基因,该序列全长429bp,编码142个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为15.7kD和4.36。预测蛋白具有昆虫气味结合蛋白典型的6个保守的半胱氨酸残基的特征,进一步分析表明Ace...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孔畅仪 王桂荣 刘杨 严善春
【目的】克隆小菜蛾(Plutella xylostella)触角中3个气味受体基因,明确这3个气味受体在不同组织中的表达分布,进而推测这3个基因的功能,为进一步深入研究奠定基础。【方法】通过新一代高通量测序技术对小菜蛾成虫触角进行转录组测序,获得小菜蛾的转录组数据信息,通过对高质量序列的拼接组装、基因鉴定和功能注释,并通过Blastx基于数据库进行相似性比对分析,预测小菜蛾的气味受体候选基因;设计引物通过克隆得到3条普通气味受体基因的全长序列,并利用半定量RT-PCR研究其在雌、雄成虫9个不同组织中的表达。【结果】根据预测的基因序列,设计特异引物,克隆得到3条普通气味受体基因的全长序列,分别命...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王伟 白俊杰 劳海华 叶星 罗建仁
根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物,应用逆转录 聚合酶链式反应(RT PCR)方法,从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA,回收纯化后克隆到pGEM TEasyVector系统的T载体上。重组子的序列分析表明:所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp,编码240个氨基酸,包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明,草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性,其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高,为87...
关键词：
草鱼 Mx蛋白基因 基因克隆 原核表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
冯一璐 傅晓斌 吴帆 崔宏春 李红亮
【目的】茶尺蠖(Ectropis obliqua)是中国茶区主要的鳞翅目害虫,其幼虫暴食性常给茶园带来巨大损失。鳞翅目昆虫雌雄个体间普遍存在着性信息素通讯环节,而茶尺蠖性信息素识别途径一直鲜有报道。论文旨在通过对茶尺蠖性信息素识别过程中的结合蛋白基因进行鉴定和功能研究,为茶尺蠖性信息素化学通讯和嗅觉信息识别传递机制提供理论依据。【方法】利用RT-PCR技术对从雄虫触角转录组数据中首次鉴定和发现的一个茶尺蠖信息素结合蛋白基因(pheromone-binding protein,PBP)2(EoblPBP2)
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
曹馨月 黄嫒媛 赵骁 王敦 冯纪年
【目的】获得苹果蠹蛾性信息素结合蛋白Ⅱ(CpomPBP2)基因的全长序列,并在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达,为探明苹果蠹蛾雌雄间的信息素交流机制奠定基础。【方法】提取苹果蠹蛾触角总RNA,利用RT-PCR、3′-RACE和5′TAIL-PCR扩增技术获得CpomPBP2基因的全长序列;通过构建原核表达载体pET28aCpomPBP2对CpomPBP2进行重组表达与检测;并对融合蛋白pET28a-CpomPBP2进行Western blot鉴定及可溶性鉴定。【结果】以苹果蠹蛾触角总RNA为模板合成cDNA第一链,以cDNA为模板经RT-PCR、3′-RACE和5′TAILPCR扩增,得到...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
曹馨月 黄嫒媛 赵骁 王敦 冯纪年
【目的】获得苹果蠹蛾性信息素结合蛋白Ⅱ（ＣｐｏｍｐＢｐ２）基因的全长序列，并在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中融合表达，为探明苹果蠹蛾雌雄间的信息素交流机制奠定基础。【方法】提取苹果蠹蛾触角总ＲＮＡ，利用ＲＴ－ｐＣＲ、３′－ＲＡＣＥ和５′ＴＡＩＬ－ｐＣＲ扩增技术获得ＣｐｏｍｐＢｐ２基因的全长序列；通过构建原核表达载体ｐＥＴ２８ＡＣｐｏｍｐＢｐ２对ＣｐｏｍｐＢｐ２进行重组表达与检测；并对融合蛋白ｐＥＴ２８Ａ－ＣｐｏｍｐＢｐ２进行ＷＥｓＴＥＲＮ ＢＬｏＴ鉴定及可溶性鉴定。【结果】以苹果蠹蛾触角总ＲＮＡ为模板合成ＣＤＮＡ第一链，以ＣＤＮＡ为模板经ＲＴ－ｐＣＲ、３′－ＲＡＣＥ和５′ＴＡＩＬｐＣＲ扩增，得到．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王玉卿 赵继新 庞玉辉 降彦苗 陈新宏 武军 刘淑会
【目的】克隆华山新麦草(Psathyrostachys huashanica)的α-醇溶蛋白基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。【方法】采用同源克隆法从华山新麦草基因组DNA中分离克隆出α-醇溶蛋白基因并进行序列分析,将克隆的华山新麦草α-醇溶蛋白基因Gli-Ns-5克隆到表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET28a-Gli-Ns转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达。【结果】从华山新麦草基因组DNA中克隆了4个α-醇溶蛋白基因:Gli-Ns-2(FJ713595)、Gli-Ns-3(GQ139525)、Gli-Ns-4(GQ1...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
邓杰夫 李魏 雷玲 洪艳云 刘双清 戴良英 易图永
为进一步了解柑橘黄龙病菌亚洲种Clas的致病机理，从Prasad预测的166种分泌蛋白中选取1个在柑橘植株中表达量较高的CLIBASIA–04580基因进行研究。提取感染柑橘黄龙病的柑橘叶片总DNA，经 PCR扩增得到 CLIBASIA–04580基因，切胶回收PCR产物双酶切连接到pET–28a载体上，使用菌落PCR和限制性内切酶双酶切鉴定筛选阳性克隆；转化大肠杆菌 BL21(DE3)，使用0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 诱导重组蛋白表达融合组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白，聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS–PAGE)检测重组蛋白的表达水平，然后使用蛋白纯化镍柱进行纯化。结果表明，携带组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白得到表达，且异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为1.5 mmol/L时相对表达量达到峰值，通过SDS–PAGE凝胶分析，与未经过镍柱纯化的蛋白原液比较可知成功纯化了CLIBASIA–04580重组蛋白。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
邓杰夫 李魏 雷玲 洪艳云 刘双清 戴良英 易图永
为进一步了解柑橘黄龙病菌亚洲种Clas的致病机理，从Prasad预测的166种分泌蛋白中选取1个在柑橘植株中表达量较高的CLIBASIA–04580基因进行研究。提取感染柑橘黄龙病的柑橘叶片总DNA，经 PCR扩增得到 CLIBASIA–04580基因，切胶回收PCR产物双酶切连接到pET–28a载体上，使用菌落PCR和限制性内切酶双酶切鉴定筛选阳性克隆；转化大肠杆菌 BL21(DE3)，使用0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 诱导重组蛋白表达融合组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白，聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS–PAGE)检测重组蛋白的表达水平，然后使用蛋白纯化镍柱进行纯化。结果表明，携带组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白得到表达，且异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为1.5 mmol/L时相对表达量达到峰值，通过SDS–PAGE凝胶分析，与未经过镍柱纯化的蛋白原液比较可知成功纯化了CLIBASIA–04580重组蛋白。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
袁志栋 王志亮 刘雨田 吴晓东 赵永刚 刘海生
目的克隆、分析水牛朊蛋白(prionprotein,PrP)成熟片段基因,并获取纯化的表达产物。方法将应用PCR技术扩增的水牛成熟PrP的核酸序列克隆到表达载体pET-32a,并分析其序列;把阳性克隆质粒pET-32a-BPrP转化表达菌BL21(DE3),鉴定纯化的表达产物。结果水牛朊蛋白成熟片段核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其他牛科动物的成熟PrP核酸、氨基酸序列间的相似性分别在97.1%和97.2%以上,并且发现水牛成熟PrP有5个重复序列,编码的氨基酸序列其中有2个九肽和3个八肽重复序列。具有较高的表达水平的PrP融合蛋白被纯化后,用Western印迹实验证明该蛋白具有PrP抗原活...
关键词：
水牛成熟PrP 克隆 序列分析 原核表达
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