【目的】利用全局性调控因子环腺苷酸受体蛋白(cyclic AMP receptor protein,Crp)基因在刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)中的过量表达,研究其对刺糖多孢菌生长及形态方面的影响,促进多杀菌素的生物合成。【方法】PCR扩增环腺苷酸受体蛋白基因(crp),通过限制性酶切、连接方法构建中间载体pOJ260-cm-PermE-crp,使crp置于红霉素增强型启动子PermE的控制下;PCR扩增PermE-crp基因片段,利用Red/ET同源重组技术将PermE-crp亚克隆至实验室保藏的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pUC-spn上,构建成Crp表达载体...

【目的】已有研究获得鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白(oligoadenylate synthase-like protein,OASL)基因全长,并且证明其可以抑制鸭坦布苏病毒复制。因此在通过原核表达和多克隆抗体制备技术获得带有GST标签的鸭寡腺苷酸合成酶样融合蛋白和该融合蛋白的特异性抗体,为进一步明确鸭寡腺苷酸合成酶样蛋白抑制病毒复制分子机制提供物质基础。【方法】根据前期研究已经获得的鸭OASL基因开放阅读框(open reading frame,ORF)序列设计全长扩增引物pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R。利用动物组织总RNA提取试剂盒提取健康樱桃谷鸭幼鸭脾脏总RNA;通过RT-PCR,利用随机引物和M-MLV反转录酶扩增获得鸭脾脏cDNA,以cDNA为模板,利用设计合成的pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R引物进行PCR扩增,扩增后的产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,检测后将片段大小与目的条带大小相同的PCR产物切胶纯化,纯化后的产物克隆到pEASY-T1载体,挑取单克隆菌落送基因公司测序,测序验证正确的PCR纯化产物通过限制性内切酶Bam H I和Xho I酶切连接至带GST标签的原核表达载体pGEX-4t-1。重组质粒转化到大肠杆菌BL21(PLYSS)~(TM),经终浓度为0.5 mmol·L~(-1)的IPTG诱导表达4 h后检测该融合蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE和Western-blotting分析融合蛋白的表达。利用GST柱亲和纯化上清中的可溶性融合蛋白,经20 mmol·L~(-1) Tris-HCL和0.10 mol·L~(-1)NaCL溶液透析后获取纯化的融合蛋白,采用SDS-PAGE分析纯化的融合蛋白。采用皮下多点注射方法免疫新西兰白兔,经3次免疫后制备多克隆抗血清,采用SDS-PAGE和间接免疫荧光检测抗体的纯度和效价。【结果】克隆测序结果表明,设计合成的鸭OASL基因全长扩增引物pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R能够从樱桃谷鸭脾脏中获得鸭OASL基因ORF序列,并且序列组成与前期研究结果一致。被扩增的序列经酶切后,鸭OASL基因能够与pGEX-4t-1载体成功连接,IPTG诱导后可以在大肠杆菌BL21(PLYSS)TM中表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blotting分析显示,融合蛋白大小约为84 kD,主要以可溶性蛋白形式表达,在包涵体中也有少量表达。经GST亲和层析纯化上清中的可溶性鸭OASL融合蛋白,得到0.5 mmol·L~(-1)纯度抗原蛋白。经3轮免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,纯化后ELISA结果显示鸭OASL蛋白抗体具有较好的灵敏度,最高效价为1:512 000,SDS-PAGE结果显示抗体大小为55 kD,与ORF理论值相同,且抗体纯度为90%以上。【结论】设计合成的引物能够成功地获得鸭脾脏OASL基因ORF序列,该ORF能够在原核细胞中成功表达,表达的融合蛋白通过免疫新西兰兔能够获得高纯度和高效价的鸭OASL多克隆抗体,研究成果为后续深入研究鸭OASL蛋白抑制病毒复制分子机制奠定坚实的物质基础。

【目的】获得玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)环腺苷酸磷酸二酯酶(c AMP phosphodiesterase,PDE)基因,并分析其在病菌侵染结构发育过程及侵染寄主早期阶段中的表达,为深入探索c AMP信号途径调控病菌致病性的作用机制打下基础。【方法】根据酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、绿僵菌(Metarhi

为探究长链脂酰辅酶A合成酶(Long-chain acyl-CoA synthetases,ACSLs)在绵羊脂肪组织的表达规律,利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)和双荧光素酶活性检测系统等方法进行研究。结果表明:1)绵羊ACSL1基因因选择性多聚腺苷酸化(Alternative polyadenylation,APA)存在2个不同长度的3′UTR;2)较短的3′UTR在绵羊前体脂肪细胞诱导分化前期更活跃,并且短3′UTR更有助于ACSL1蛋白表达;3)miR-202、miR-449a、miR-124a、miR-218均可与ACSL1 3′UTR结合,降低荧光素酶活性,其中miR-218通过与ACSL1 3′UTR的1 264～1 271bp处结合可显著降低ACSL1表达。综上,ACSL1基因因选择性多聚腺苷酸化存在不同长度的3′UTR,且短3′UTR有助于基因表达;miR-218可显著下调ACSL1基因表达。本研究为绵羊ACSL1基因的进一步研究提供理论依据。

对乳酸菌素plnJ-K基因序列进行优化,利用基因串联表达技术构建重组串联表达载体pET-32a-pln-J-K,并将pET-32a-pln-J-K转化到大肠杆菌BL21中;对温度、时间、IPTG浓度等诱导条件进行优化,并与优化前的表达量进行对比.SDS-PAGE检测结果表明,在IPTG浓度为0.6 mmol·L~(-1),温度为37℃,时间为12 h的诱导条件下,目的蛋白的表达量最多.蛋白质印迹法鉴定结果表明,目的蛋白被正确表达.

鼠李糖和福乐糖胺是多杀菌素生物合成必需的2个脱氧糖结构单元,负责其合成的4种酶的基因(gtt、epi、gdh、kre)与多杀菌素生物合成基因簇并不在一起,而是分散分布在染色体的3个位点上。为克隆到完整的多杀菌素生物合成基因簇,采用构建基因组文库、PCR扩增等手段从刺糖多孢菌NRRL18395染色体分别克隆gtt、epi、gdh和kre基因,并将其克隆组装在同一整合型载体上,以便于构建用于表达多杀菌素糖单元合成基因的表达载体。

利用RACE技术获得了斑节对虾(Penaeus monodon)ANT基因(PmANT)的cDNA序列。该序列全长1 388 bp,开放阅读框(ORF)为930 bp,3'非编码区(UTR)为393 bp,5'非编码区(UTR)为65 bp。ORF可编码309个氨基酸,分子量大约为33.622 ku。与所有ANT家族成员一样,PmANT蛋白具有3个重复同源的线粒体跨膜结构域,但不含信号肽和糖基化位点。相似性、同源性及系统进化树分析显示,斑节对虾的ANT基因与凡纳滨对虾的同源性和相似性最高,并与其聚为一支。采用荧光定量的方法研究了ANT基因在雌雄个体不同组织、卵巢不同发育阶段及未成熟和成熟精巢的...

为研究可溶性腺苷酸环化酶(sAC)基因的组织特异性表达及其在不同周龄小鼠睾丸中的表达情况,探讨其在精子发生及获能中的作用,运用RT-PCR法分析小鼠sAC基因的组织表达情况及其发育的时序性变化。结果显示,sAC基因优先表达于睾丸和附睾,表达量随发育周龄的增长而呈增加趋势:于2周龄开始检测到它的表达,随后表达量显著增加至6周龄,再逐渐增长至一个平台期,呈现出发育阶段性,说明sAC在精子形成及获能过程中具有特殊作用。

本研究根据半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)基因组数据库中预测的多聚免疫球蛋白受体(Polymeric immunoglobulin receptor, pIgR)序列,通过PCR和RACE技术获得了半滑舌鳎pIgR基因cDNA,全长为1419 bp,开放阅读框(ORF)为1020 bp,编码339个氨基酸,5′UTR区域为109 bp,3′UTR区域为290bp。保守结构域分析显示,半滑舌鳎pIgR蛋白包含1个信号肽,2个免疫球蛋白功能域(Ig-like domain, ILD)和1个跨膜结构域。经蛋白序列同源比对和系统进化树分析,发现半滑舌鳎pIgR与大菱鲆(Scophthalmus maximus)和牙鲆(Paralichthy solivaceus)的pIgR亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,pIgR基因在健康半滑舌鳎的不同组织中均有表达,在鳃中表达较高,在肌肉中表达最低。经哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)病原感染刺激后,pIgR基因在半滑舌鳎的5个组织(肝脏、脾脏、肾脏、肠和鳃)中均呈先上升后下降的趋势,其中,在脾脏和鳃中48 h达到最高值,在肝脏、肾脏和肠中72 h达到峰值。与内脏组织不同的是,pIgR基因在皮肤中呈一直上升的趋势。上述结果表明,pIgR基因在半滑舌鳎抵御哈维氏弧菌的免疫应答中发挥重要作用。

【目的】研究槲皮素对肉鸡脂肪细胞甘油三酯沉积过程中环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)信号通路的作用。【方法】将脂肪细胞随机分5组,每组6个重复;空白对照组为基础培养液,溶剂对照组为含2‰二甲基亚砜(DMSO)的培养液,试验组为含10、20和40 mg.L-1槲皮素的培养液,分别于24、48和72 h收集细胞及培养液;ELISA法测定乙酰CoA羧化酶(acetyl CoA carboxylase,ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acidsynthase,FAS)、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)、cAMP、腺苷酸环化酶...

用灌注法自家兔获取运动正常的日本血吸虫，在含１０％灭活胎牛血清的Ｅａｒｌｅ氏缓冲盐溶液（含或不含药物）中３７℃培养１ｈ。显微镜下观察其运动性并测量虫长。用放免法测定３７℃培养３ｈ的日本血吸虫环腺苷酸（ｃＡＭＰ）的含量。结果表明：５－羟色胺（１０－４ｍｏｌ／Ｌ）、色胺（１０－４ｍｏｌ／Ｌ）、阿托品（１０－４ｍｏｌ／Ｌ）、吡喹酮（１０－７ｍｏｌ／Ｌ、１０－６ｍｏｌ／Ｌ）和硝硫氰醚（１０－４ｍｏｌ／Ｌ）兴奋日本血吸虫；赛庚啶（１０－４ｍｏｌ／Ｌ）、乙酰胆碱（１０－５ｍｏｌ／Ｌ、１０－４ｍｏｌ／Ｌ）和槟榔碱（１０－４ｍｏｌ／Ｌ）抑制日本血吸虫的运动性；色氨酸（１０－４ｍｏｌ／Ｌ）对运动性影响不明显。上...

为分析苜蓿素对脂多糖诱导下体外培养奶牛乳腺上皮细胞抗炎和乳蛋白合成相关基因表达的影响,本研究将体外培养的奶牛乳腺上皮细胞分成4组,即基础培养基(对照)和基础培养基中分别加入1μg·m L-1LPS(L)、1μg·m L-1LPS+10μg·m L-1苜蓿素(L+T)和10μg·m L-1苜蓿素(T)。结果显示,1)与对照组相比,L组奶牛乳腺上皮细胞的活性显著下降(P<0.05),而T组则显著升高(P<0.01)。2)L+T组细胞的超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于L组(P<0.01),而一氧化氮(NO)

为探讨饲料中不同蛋白源(菜籽粕、发酵豆粕、鸡肉粉、肉骨粉)替代50%鱼粉对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)生长、消化酶活性及生长轴基因表达的影响。以克氏原螯虾(9.84±0.49)g为研究对象,将其分为5组(对照组、菜籽粕组、发酵豆粕组、鸡肉粉组、肉骨粉组),分别投喂不同蛋白源的实验饲料,养殖周期6周。结果显示:发酵豆粕组的增重率最高,但与对照组差异不显著;菜籽粕组的增重率显著低于对照组。发酵豆粕组、鸡肉粉组和肉骨粉组的肝胰脏蛋白酶活性与对照组差异不显著,菜籽粕组肝胰脏蛋白酶活性显著性低于对照组;发酵豆粕组脂肪酶活性最高,但与对照组差异不显著。发酵豆粕组小肠的胰岛素生长因子受体(IGF1R)相对表达量与对照组差异不显著,但显著高于其他三组;菜籽粕组、发酵豆粕组和肉骨粉组肝脏的IGF1R相对表达量显著高于对照组。结果表明:比较4种蛋白源替代50%鱼粉,发酵豆粕效果最佳,肉骨粉和鸡肉粉次之,菜籽粕最差。

对已分离的1株致病性鳗弧菌W1外膜蛋白图谱进行SDS-PAGE分析,并与8株不同血清型的鳗弧菌外膜蛋白进行比较。结果表明,鳗弧菌W1主要外膜蛋白分别为24 kD,38 kD,42 kD和47 kD,主要外膜蛋白图谱与鳗弧菌O1血清型标准菌株VIB1相似。抗生素药敏试验表明该菌对氨苄青霉素、强力霉素、磺胺嘧啶等14种常用药物产生了抗性,只对新生霉素、呋喃妥因、利福平、新霉素等9种药物敏感。研究不同浓度的氨苄青霉素、强力霉素、磺胺嘧啶和庆大霉素对鳗弧菌外膜蛋白表达的影响。结果表明,氨苄青霉素、强力霉素和磺胺嘧啶明显地抑制鳗弧菌42 kD的主要外膜蛋白的表达,随着抗菌素浓度的增加,该外膜蛋白的表达量...

鱼类多聚免疫球蛋白受体(polymeric immunoglobulin receptor,pIgR)是黏膜免疫系统的关键因子,能够介导多聚免疫球蛋白向黏液中的转运和分泌。本研究利用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification ofcDNA ends,RACE),首次得到了大菱鲆(Scophthalmus maximus)pIgR完整的cDNA序列,全长1 584 bp,该序列包含一个1 005 bp的开放阅读框及5’和3’UTR,编码334个氨基酸。同源性比较发现,大菱鲆pIgR氨基酸序列与牙鲆(Paralichthys olivaceus)、斜带石斑鱼(Epi...