噬菌体是地球上最丰富和最多样化的生物实体,其数量是细菌的10~100倍。它们感染易感细菌宿主,并通过转导作用在宿主细胞内繁殖或以前噬菌体形式整合自身基因至细菌基因组中,从而有助于它们在细菌宿主中的繁殖(短期)或进化(长期)。利用荧光定量PCR方法(q PCR)对不同环境来源的噬菌体基因进行定量分析,发现其基因组中携带大量的耐药基因(ARG),其中检出率及丰度最高的为耐β-内酰胺抗生素的基因,主要为blaTEM、blaCTX-M-groups、blaSHV、blaNDM和blaKPC,以及耐氟喹诺酮类药物的基因qnr A、qnr B和qnr S。且随着高通量测序方法的不断改进,用此方法针对不同样品的宏基因组测序结果分析也同样发现了高水平ARG的存在。这些结果表明噬菌体可能成为潜在的储存载体,促进抗生素耐药性的传播。本文将从荧光定量PCR(q PCR)方法和全基因组测序方法两方面综述全球不同环境样本中噬菌体基因组携带ARG的情况以及其多样性和丰度的研究进展,并讨论其潜在危害性,希望引起更多的关注。

随着水产养殖业的发展,养殖密度越来越高,细菌性疾病暴发频繁。现如今主流抗菌手段是抗生素,但其大规模且不规范的使用使得细菌耐药性问题越发严重。为了有效防治水产细菌性疾病,加快推进水产养殖业绿色发展,促进产业转型升级,人们亟需寻求新的抗菌手段来缓解当今的局面。噬菌体是一种感染细菌和古细菌的病毒,具有专一性强、不易产生抗性、代谢快、易开发及成本低等优点。在国内外被广泛研究,同时也被应用于多种疾病的防控,其相关产品也获得认可,但其本身存在的限制也不容忽视。本文首先综合介绍了噬菌体治疗的原理和优势,然后对噬菌体治疗在水产养殖动物细菌性疾病中的研究进展进行综述,并对噬菌体治疗现存的困难和应对策略进行讨论,最后在此基础上作出展望,期望能够为后续噬菌体在水产上的应用研究提供参考。

为了解载体介导噬菌体入胞及抗胞内寄生菌的最新研究进展，利用文献综述法检索近年载体介导噬菌体入胞的相关文献，从功能发挥、试验技术及应用前景等方面对可应用于介导噬菌体入胞的载体进行整理讨论。结果表明：1)噬菌体作为一类能够感染和裂解细菌的病毒，其天然存在的抗菌特性使其作为抗生素替代物的研究广泛存在，但其靶向胞内寄生菌的基础研究主要集中在国外，国内鲜有报道。2)与游离噬菌体相比，以无机纳米微粒、脂质体等作为载体介导噬菌体入胞，能够防止噬菌体被宿主免疫系统清除和免受细胞内环境影响。3)脂质体因其作为载体可有效提高噬菌体入胞效率及杀菌效率，现已成为研究最广泛的噬菌体入胞载体之一。因此，本文综述近年来国内外关于载体介导噬菌体入胞及抗胞内寄生菌研究进展，详细阐述不同介导噬菌体入胞的载体特性、入胞机制以及如何提高入胞效率等方面的最新研究，并针对目前存在的问题和发展前景进行展望，以期为更有效地利用载体投递系统高效投递噬菌体解决细胞内细菌感染的实际问题提供参考与理论支撑。

【目的】研究大肠埃希氏细菌中超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrumβ-lactamases,ESBLs)耐药质粒的传播及氯丙嗪对其的消除效果。【方法】采集河南开封和安阳疑似大肠埃希氏细菌病病死鸡、猪典型病料,经细菌学检验后,用试管二倍稀释法测定头孢噻呋和头孢曲松对致病性大肠埃希氏细菌的最小抑菌浓度(MIC),用双纸片协同法和PCR扩增法进行ESBLs检测。以安阳猪和开封鸡大肠埃希氏细菌作供体菌、DH5α为受体菌,进行ESBLs耐药质粒的接合传递试验。用氯丙嗪作消除剂,以SDS为对照,对大肠埃希氏细菌分离株ESBLs耐药质粒进行消除试验。【结果】从疑似大肠埃希氏细菌典型病料中分离...

本文综述了噬菌体展示技术的研究现状和发展趋势 ,着重描述了噬菌体展示技术的筛选方法及其在生命科学研究领域的广泛应用 ,结合目前我国天牛防治存在的问题 ,分析了噬菌体展示技术在天牛防治技术研究中的应用潜力

【目的】为了进一步验证GyrA基因突变与氟喹诺酮耐药性的关系,阐明与染色体无关的细菌耐药性或耐药基因垂直传递和水平传递特点,阐明控制抗菌药使用对控制细菌耐药性的作用。【方法】用PCR方法扩增了细菌GyrA和ParC基因;用耐四环素(TE)、氨苄青霉素(AMP)、复方新诺明(SXT)的大肠杆菌做供体菌,对TE、AMP、SXT敏感的大肠杆菌作受体菌,进行了体外结合传递试验;用耐药菌株在营养琼脂上垂直传递20代;在2组不携带耐药菌的SPF鸡消化道内分别接种多重耐药大肠杆菌和沙门氏菌,接种后混合饲养。【结果】发现耐环丙沙星(CIP)和恩诺沙星(ENR)菌株的GyrA基因表达的氨基酸第73和78位发生改...

【背景】在中国，柑橘黄龙病（citrus Huanglongbing,HLB）是由候选韧皮部杆菌亚洲种（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas）所引起的一种毁灭性病害，严重威胁着柑橘产业的可持续发展。前期研究表明CLas全基因组上鉴定出3种单独类型的原噬菌体基因序列，而广东黄龙病菌主要以Type-2原噬菌体类型和Type-1+3混合原噬菌体类型为主。这两种CLas菌株在传病媒介——柑橘木虱（Diaphorina citri）体内的增殖及其对寄主植物的致病力差异依然不清楚。【目的】比较Type-2-CLas菌株和Type-1+3-CLas菌株在柑橘木虱体内的增殖能力和对砂糖橘（Citrus reticulata Blanco cv.Shatangju）的致病力差异。【方法】嫁接准备含有不同CLas菌株的砂糖橘，分别将50头柑橘木虱若虫和50头成虫放置到含有不同CLas菌株的砂糖橘嫩梢上刺吸获菌6、12、18 d，利用荧光定量PCR检测并统计柑橘木虱若虫期、成虫期对Type-2-CLas和Type-1+3-CLas的获菌率和获菌量差异。饲养分别携带Type-2-CLas和Type-1+3-CLas菌株的柑橘木虱种群，分别将携带Type-2-CLas和Type-1+3-CLas菌株的20头柑橘木虱成虫置于健康砂糖橘嫩梢上刺吸2周，移除木虱后统计柑橘木虱获菌率和获菌量，每月追踪砂糖橘症状变化和叶片病菌浓度，利用光学显微镜观察接种360 d时叶片韧皮部和薄壁细胞形态学变化情况。【结果】柑橘木虱以若虫形态对Type-2-CLas和Type-1+3-CLas菌株的获菌率和获菌量无显著差异，但柑橘木虱以成虫形态对Type-2-CLas的获菌率和获菌量显著高于Type-1+3-CLas菌株。在虫传后120 d时接种Type-2-CLas菌株的叶片附近新叶会呈现更严重的斑驳症状。Type-2-CLas菌株侵染砂糖橘一年后抽出的新叶转绿不正常，出现均匀黄化、小叶的明显症状，而Type-1+3-CLas菌株新叶症状则为典型斑驳和革质化。叶片解剖观察结果发现，在叶片病菌浓度相近的情况下，相比于接种了Type-1+3-CLas的叶片，接种了Type-2-CLas菌株的叶片韧皮部细胞发生更严重的细胞塌缩，在叶脉和叶肉薄壁细胞内造成较多的淀粉粒积累。【结论】Type-2-CLas比Type-1+3-CLas更容易在柑橘木虱成虫体内增殖，且达到较高的病菌浓度，间接证明了Type-2-CLas菌株具有高传染性。感染Type-2-CLas的新叶呈现均匀黄化、叶小的症状，而感染Type-1+3-CLas的新叶呈现较为斑驳和革质化的症状，Type-2-CLas比Type-1+3-CLas造成更严重的叶脉韧皮部塌缩和淀粉粒积累情况，说明Type-2-CLas比Type-1+3-CLas对柑橘具有更强的致病力。

为研究耐黏菌素大肠杆菌的噬菌体治疗方法，本研究以耐黏菌素大肠杆菌为宿主菌，采用双层琼脂平板法从山东烟台某养鸡场污水样中分离纯化得到裂解性噬菌体SDYTW1-F1-2-2。通过透射电镜观察，最佳感染复数，一步生长曲线，温度稳定性，酸碱度稳定性等生物学特性测定，并对其进行全基因组测序分析。结果表明：1）噬菌体SDYTW1-F1-2-2噬菌斑呈现透亮，外周无晕圈，形态学观察显示其具有可伸缩性尾鞘。2）生物学特性分析表明，噬菌体最佳感染复数为0.1，潜伏期为50 min，爆发期为40 min，爆发量为（331±9）PFU/cell。在温度4～40℃，pH为4～12的环境下，噬菌体活性较为稳定。3）通过噬菌体全基因组测序及核酸类型鉴定显示，该噬菌体基因组全长为74 752 bp，双链DNA,GC含量42.1%。在噬菌体基因组中共鉴定出121个编码蛋白（CDS），包括结构组成、DNA代谢与复制和包装以及细菌裂解相关的功能基因，发现一个tRNA基因，且未检测到如stx-1等致病性基因和mcr-1等耐药基因相关的基因。综上，噬菌体SDYTW1-F1-2-2裂解谱较宽，具有良好的酸碱性、热稳定性以及安全性。本研究为后续开展针对耐黏菌素大肠杆菌的噬菌体治疗研究提供依据。

为探究噬菌体作为新型生物抗菌剂防控肺炎克雷伯菌引起的奶牛乳房炎和乳制品及其加工过程污染，以及对生物被膜清除的能力，以ATCC 700603为宿主菌从某牛场水样中分离得到1株肺炎克雷伯菌噬菌体vB＿KpnM-YP11，并通过透射电镜观察噬菌体形态特征；通过双层平板法测定噬菌体宿主谱；通过最佳感染复数、一步生长曲线、温度和pH稳定性测定噬菌体生物学特性；通过全基因组测序分析基因组的结构特征、比较其进化关系；通过结晶紫染色法和平板计数法测定噬菌体对生物被膜的抑制和清除效果；通过牛奶试验分析该噬菌体对牛奶中肺炎克雷伯菌的抑菌效果。结果表明：1）从牛场水样中分离获得肺炎克雷伯菌噬菌体vB＿KpnM-YP11，能形成清晰透亮噬菌斑，透射电镜观察vB＿KpnM-YP11具有肌尾噬菌体的典型结构。2）测定噬菌体宿主谱，表明vB＿KpnM-YP11能够裂解18/34株牛源肺炎克雷伯菌。3）生物学特性结果表明vB＿KpnM-YP11最佳感染复数为0.1,vB＿KpnM-YP11感染宿主菌潜伏期为30 min，爆发期为50～90 min,110 min后进入平台期，平均裂解量为69PFU/cell，在pH(3～11)和温度（4～60℃）范围内活性稳定。4)vB＿KpnM-YP11基因组全长166 607 bp,GC含量为39.52%，注释结果显示共有276个ORF和15个tRNA，不含耐药基因及毒力基因。5)vB＿KpnM-YP11最佳感染复数为0.1时，具有显著抑制肺炎克雷伯菌生物被膜的形成能力。vB＿KpnM-YP11效价为10～8 PFU/mL,10～9 PFU/mL能有效清除肺炎克雷伯菌生物被膜。在室温条件下，12 h内vB＿KpnM-YP11使牛奶中细菌浓度下降98%。综上，本研究分离获得噬菌体vB＿KpnM-YP11潜伏期短、裂解效率高，不仅能抑制和清除生物被膜，同时对牛奶中肺炎克雷伯菌也有显著的抑菌效果，具有作为肺炎克雷伯菌生物抗菌剂的应用潜力。

对盆栽水稻采用针刺、喷雾、盆水等不同方法接种水稻细菌性条斑病病菌后 ,检测稻株发病和盆水中的噬菌体 ,结果表明 :未接种稻细条病菌的处理中 ,无稻株发病 ,盆水中也未测到噬菌体 ;3种接种处理均可引致稻株发病 ,并先后在其盆水中检测到噬菌体 ,说明噬菌体与致病菌有密切的伴随关系。在采用叶面喷雾和盆水接种稻白叶枯自然组合菌株B 1和单细胞系菌株Ⅳ 16试验中 ,B 1处理后能引起稻株发病 ,且在盆水中测到噬菌体 ;而Ⅳ 16处理后虽引起稻株发病 ,但盆水中无噬菌体 ,结果表明 :在人工接种条件下植物病原细菌噬菌体是由病菌中的溶原细胞传带而来的

【目的】通过原噬菌体区域高度变异的基因位点研究柑橘黄龙病病原菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’)的种群分化,探讨病原菌种群遗传多样性水平和遗传结构。【方法】基于2种原噬菌体类型(SC1和SC2)对应的超变异基因区域设计2对引物(Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2),对中国不同柑橘产区的224个‘Ca.L.asiaticus’株系进行PCR检测和序列分析。【结果】PCR扩增的条带类型呈多态性,具有4种条带类型(SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2),西南地区以SC1-1型为主,广东、广西地区以SC2-...

【背景】解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora）是仁果类果树火疫病的病原体，对全球苹果和梨的生产构成严重威胁。随着抗生素耐药菌株的出现，火疫病的防治面临巨大的挑战。【目的】分离一种新的裂解解淀粉欧文氏菌的噬菌体，并分析该噬菌体裂解相关基因的功能，为火疫病的防治提供新的选择。【方法】以解淀粉欧文氏菌Ea102为宿主菌，采用双层平板法从流行火疫病的果园土壤中分离噬菌体。通过噬菌斑和透射电镜观察其形态。用PacBio测序技术测定噬菌体基因组，SPAdes组装序列，RAST注释基因组。通过大肠杆菌原核表达系统分析噬菌体Kuerle的裂解机制。【结果】分离纯化出一株裂解解淀粉欧文氏菌的噬菌体，命名为Kuerle。Kuerle由二十面体衣壳的头部和短尾组成，潜伏期约为50 min，裂解量约为240 pfu/cell。噬菌体基因组全长75 599 bp,GC含量48.0%，末端有393 bp的重复序列，未发现与溶原调控相关的基因。共预测到85个开放阅读框（open reading frame,ORF），其中33个已知功能蛋白中包含一个由3 550 aa组成的巨大病毒颗粒相关的RNA聚合酶（virion-associated RNA polymerase,vRNAP），该vRNAP是Schitoviridae科噬菌体的主要特征之一。病毒粒子和基因结构表明噬菌体Kuerle属于有尾噬菌体类的Schitoviridae科病毒。聚集在DNA晚期表达区的3个裂解相关基因holin、endolysin和spanin组成了“裂解盒”。在大肠杆菌中Kuerle-holin的表达会抑制细胞的生长，而Kuerle-endolysin的表达可裂解细胞。二者共表达时Kuerle-holin会加速Kuerle-endolysin引起的细胞裂解。用叠氮化钠抑制细菌的一般分泌系统（Sec）或Kuerle-endolysin N端信号序列的缺失均会导致endolysin裂解功能丧失。上述结果表明噬菌体Kuerle具有pinholin-SAR endolysin裂解系统。Kuerle-holin(pinholin)使细胞质膜去极化以激活分泌的Kuerle-endolysin(SAR endolysin)降解肽聚糖层。【结论】Kuerle是一株烈性噬菌体并且Kuerle-endolysin抑菌效果显著，为后续火疫病生防试剂的制备提供了理论依据和研究材料。

急性肝胰腺坏死病（Ａｃｕｔｅ ＨｅｐＡｔｏｐＡｎｃｒｅＡｔｉｃ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ＤｉｓｅＡｓｅ，ＡＨｐｎＤ）是由副溶血弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｐＡｒＡＨＡｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）引起的对虾病害，本研究从患ＡＨｐｎＤ的凡纳滨对虾样品中分离得到５株副溶血弧菌，采用致ＡＨｐｎＤ的副溶血弧菌（ＶｐＡＨｐｎＤ）的相关质粒的引物Ａｐ２进行ｐｃｒ检测，表明这５株菌中均存在ＡＨｐｎＤ相关质粒。利用丝裂霉素ｃ进行溶源性噬菌体筛选和噬菌体诱导发现，其中２株副溶血弧菌（２０１３０６２９００２ｓ０１和２０１３０７２６００１ｓ０１）可能存在溶源性噬菌体感染；从经０．５μｇ／ｍｌ丝裂霉素ｃ诱导的２０１３０６２９００２ｓ０１和．．．

【目的】构建单链抗体(ScFv)噬菌体表面展示文库,从中筛选抗羊抑制素单抗并进行表达,建立制备羊抑制素单抗的新方法。【方法】用未经免疫的多种小鼠脾细胞作为基因来源,采用噬菌体抗体库技术,构建天然噬菌体表面抗体文库。用羊抑制素对其进行3轮吸附-洗脱-富集,筛选抗羊抑制素单抗,用ELISA检测其抗原结合活性。【结果】构建了天然鼠源噬菌体抗体库,为筛选和制备各种单链抗体提供了一个平台。用羊抑制素对其进行筛选,制备抗羊抑制素单抗,经ELISA检测,55/96克隆具有与羊抑制素结合活性,阳性率为57%。【结论】制备的羊抑制素可溶性ScFv及其表面展示噬菌体抗体有很好的抗原结合活性,为羊抑制素单抗的制备提...

本试验对猪流产嗜性衣原体omp-1基因噬菌体DNA疫苗进行了免疫效果评价。将猪流产嗜性衣原体omp-1基因插入λNM1149噬菌体载体构建成DNA疫苗,筛选获得阳性噬斑;使用重组的噬菌体疫苗按250 ng/只分别在第2、16和30天三次免疫Balb/c小鼠,以1B弱毒活疫苗(10μg/只)、噬菌体空载体(250 ng/只)为对照组。免疫后分别以ELISA法测定小鼠抗体以及MTT法检测淋巴细胞刺激指数。结果表明重组λ-MOMP噬菌体疫苗虽然未能在短期内(免疫第29天)激发高水平的抗体(1B组免疫第29天抗体D450=0.347,重组噬菌体组免疫第29天抗体D450=0.19;1B组免疫第43天抗...