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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
戴婷婷 陆辰晨 郑小波
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)采用特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在等温条件(60~65℃)下60 min左右进行核酸扩增,其扩增效率可达到109~1010个数量级,具有特异性强、灵敏度高、等温、操作简单和检测结果快速等优点。该技术已广泛应用于病毒、细菌、寄生虫、菌物等病原物的检测中,在人、畜和植物病原生物的快速检测和病害诊断等领域具有广阔的应用前景。本文对LAMP技术原理及其在病原物检测中的应用做了简要综述,并对LAMP技术的应用前景进行了展望。
关键词：
环介导等温扩增技术 应用 检测 病原物
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
田擎 曾丹丹 李彬 张海峰 王源超 郑小波
［目的］黑白轮枝菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｌｂｏ－ａｔｒｕｍ）能够危害苜蓿等多种作物，是我国重要的检疫性病原真菌。我们基于环介导等温扩增技术（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｌａｍｐ），建立基于颜色判定的简单、快速和灵敏的黑白轮枝菌检测方法。［方法］基于ｌａｍｐ技术，通过比对分析黑白轮枝菌与其相似种不同靶标序列间的差异，选取ｔｕｂ（β－ｔｕｂｌｉｎ，编码β－微管蛋白）基因作为靶标基因，设计并筛选了４条特异性强、灵敏度高的ｌａｍｐ引物和１条环引物，在此基础上建立了检测黑白轮枝菌的ｌａｍｐ体系，并进行特异性、灵敏度试验及田间发病组织的检测。该方法．．．
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
戴婷婷 陆辰晨 沈浩 王源超 郑小波
应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了基于颜色判定的简单、快速和灵敏的橡树疫霉菌(Phytophthora ramorum)检测方法。以ITS为靶序列对橡树疫霉菌的分子检测存在无法区分近似种的问题,笔者在橡树疫霉菌的基因组研究中,发现了PrA3aPro类转座子序列。生物信息学分析表明,该序列非常适合作为大豆疫霉分子检测的靶标。利用LAMP技术,以PrA3aPro为靶序列,设计LAMP特异性引物,建立LAMP反应体系与条件,并进行灵敏度和特异性试验。结果表明:整个检测过程仅需1 h,即可通过肉眼直接目测试验结果。...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
曾丹丹 张海峰 田擎 许苗 王源超 郑小波
［目的］通过对黄淮地区大豆种子带菌的快速检测，了解该地区大豆种子携带病原菌的情况。［方法］采用环介导等温扩增技术（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｌａｍｐ）检测黄淮地区２９个大豆主栽品种种子上平头炭疽菌、胶孢炭疽菌、尖镰孢菌、木贼镰孢菌、层出镰孢菌、黄色镰孢菌、禾谷镰孢菌、茄腐镰孢菌、大豆拟茎点种腐病菌、立枯丝核菌、大豆炭腐病菌、冬青丽赤壳菌、大豆疫霉病菌等大豆主要病原菌的携带情况。［结果］供试的２９个品种中有２０个品种的种子样本检出携带上述病原菌，分别携带所检测的１３种病原菌中的７种，检出率由高到低依次为平头炭疽菌、大豆拟茎点种腐病菌、木贼镰孢菌．．．
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李琼 岳志芹 凌宗帅 刘荭 梁成珠 陈晓 陈昌福
根据淋巴囊肿病毒的主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因保守序列,利用PrimerExplorer 3软件设计了5条引物,对LAMP反应温度和反应时间等参数进行了优化。与流行性造血器官坏死病毒、虎纹蛙病毒、蛙虹彩病毒、新加坡石斑虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒等其它虹彩病毒及对虾白斑综合症病毒都没有交叉反应。将LAMP检测方法与常规PCR进行灵敏度的比较分析,结果显示LAMP的检测灵敏度约为15 fg,比常规PCR灵敏度高一个数量级。该方法检测时间短,在1 h内即可完成检测。用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明12尾外观有淋巴囊肿病症状的...
[期刊] 水产学报
[作者]
曲朋 王崇明 任伟成 梁彦韬 贾志磊 黄倢 潘鲁青
奥尔森帕金虫是重要的贝类病原性寄生虫之一,为建立快速、灵敏、准确和使用简便的检测方法,实验根据奥尔森帕金虫5.8S rDNA中的内转录间隔区(internal transcribedspacer,ITS)序列,建立了环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对反应温度、反应体系中Mg2+浓度和反应时间进行了优化。该方法的检测灵敏度约为30拷贝质粒DNA,并且特异性较强,与海水帕金虫、包纳米虫、波豆虫及急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)等病原均无交叉反应。使用LAMP法对两...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
孙颖杰 岳志芹 刘荭 赵玉然 史秀杰 梁成珠 吴斌 李叶 王哲
建立了牙鲆弹状病毒的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,首先根据牙鲆弹状病毒的糖蛋白的基因保守序列,利用Primer Explorer V3软件设计了6条引物,并对LAMP反应温度和反应时间等条件进行了优化。该方法的检测限为30fgRNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与鲤春血症病毒、传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、海洋双RNA病毒、病毒性出血败血症病毒以及病毒性神经坏死病毒等没有交叉反应。该方法检测时间短,在1h内即可完成检测。用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明40尾石鲽鱼样品中有...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李庆玲 沈丹宇 于佳 赵媛媛 朱也 窦道龙
[目的]建立一种快速、准确的检测瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,为诊断和防治瓜果腐霉菌引起的植物病害提供技术支撑。[方法]通过比较基因组学方法,在瓜果腐霉菌基因组上筛选有序列特异性的基因作为检测的靶标基因,设计LAMP特异性引物,建立一种基于颜色判定的快速、准确的LAMP检测方法,随后对该检测方法的特异性、灵敏度和发病组织实际检测等进行分析评价。[结果]鉴定到1个编码T
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘佳 黄丛林 吴忠义 张秀海 王永勤
【目的】环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种特异、灵敏、快速的新型基因检测技术。本研究拟用该技术建立菊花中番茄不孕病毒(TAV)的检测方法。【方法】设计能识别TAV CP序列6个特定区域的4种LAMP特异引物,对MgCl2、dNTPs、甜菜碱等LAMP反应条件进行优化,利用新建的LAMP法检测TAV,比较LAMP和RT-PCR2种不同方法的检测灵敏度。【结果】建立了检测番茄不孕病毒的LAMP技术;LAMP比RT-PCR具有灵敏度更高、快速、简便等优点。【结论】建立的LAMP技术能快速、准确、简便地检测出菊花中的番茄不孕病...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
吴旭东 陆辰晨 沈浩 吴翠萍 张海峰 王源超 郑小波
[目的]应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立基于颜色判定的简便、快速和灵敏的大豆茎褐腐病菌[Phialophora gregata f.sp.sojae(PGS)]检测方法。[方法]利用LAMP技术,以ITS为靶序列,设计了4条特异性的LAMP引物和2条环引物,在此基础上建立了检测大豆茎褐腐病菌的LAMP体系。[结果]整个检测过程仅需1 h就可通过肉眼直接目测试验结果。在等温条件下(64℃)进行核酸扩增反应1 h,在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化可以判断PGS的存在与否。...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
侯圣凡 刘峻杰 李小峰 王红清
为快速鉴定Fusarium oxysporumf.sp.fragariae(Fof)引起的草莓枯萎病,主要采用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了Fof的快速检测体系,使用组织分离法和PCR法对LAMP技术辅佐验证。结果表明:25μL体系中添加Buffer 2.50μL、Mg~(2+)(100 mmol/L)0.25μL、dNTPs(10mmol/L)1.00μL、FIP和BIP(20μmol/L)各1.00μL、F3和B3(10μmol/L)各0.50μL、LoopF(10μmol/L)0.75μL、Bst DNA聚合酶(8U/μL)0.50μL、Betaine(5mol/L)1.00μL、DNA模板1.00μL和ddH_2O 15.00μL,反应结束后添加0.40μL的SYBR Green Ⅰ染料为最佳反应体系;该体系最适反应温度为62.9℃,最佳反应时间为60min;特异性试验表明该体系能从16种草莓常见病原菌中特异性检测出Fof,最低检出限为45pg/μL,比常规PCR检测效率高;随机抽取田间病害样品16株,采用LAMP体系检测罹病草莓根茎中的病原菌,其中12株感病草莓的病原菌为Fof,使用组织分离法和PCR法验证了LAMP检测结果的准确性;传统病原菌鉴定耗时约5～7d,而LAMP检测1d内便可完成。综上,本研究建立的LAMP检测体系为Fof准确快速检测及实际应用奠定了基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
席伟军 李江红 陈大福 梁勤
【目的】建立一种快速、灵敏的检测蜜蜂球囊菌（ＡｓｃｏｓｐｈＡｅｒＡ Ａｐｉｓ）的环介导等温扩增（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉＡｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍＡｌ ＡｍｐｌｉｆｉｃＡｔｉｏｎ，ｌＡｍｐ）方法，为监测和防治蜜蜂白垩病提供技术支撑。［方法］根据蜜蜂球囊菌特异性序列ｉｔｓ区，用在线引物设计软件ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ４．０设计并合成４条特异性引物Ａ．Ａｐｉｓ－ｆ３（５＇－ＡｃＡｔｔＧｃＧｃｃｃｔｃｔＧＧｔＡ－３＇）、Ａ．Ａｐｉｓ－Ｂ３（５＇－ｔＧＧｔｔＡＧＡｃｃＧＧＡｃＡＧｔｃＧ－３＇）、Ａ．Ａｐｉｓ－ｆｉｐ（５＇－ｔＡＡＧＡｃＧＧＧＡｃＧＡｔｃＧｃｃｃ ＡＡｃｃｔＧｔｃｃＧＡＧｃＧｔｃＡｔｔ．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王永 兰青阔 赵新 朱珠 程奕
【目的】建立转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法。【方法】以转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP),针对CaMV35S基因的6个区域设计4种特异引物,利用1种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃保温1h,通过荧光显色即可完成对转基因作物鉴定工作。同时对7种转基因作物进行LAMP检测。【结果】该LAMP方法通过特异性检测含有CaMV35S启动子的转基因作物,其检测结果的特异性与常规PCR方法结果一致,灵敏...
关键词：
转基因作物 环介导等温扩增技术 检测
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
庞建虎 乔龙亮 朱鹏 高威芳 章礼萍
有别于费力和费时的传统病原体检测方法,基于靶基因的分子生物学检测方法以其快速和灵敏的特点逐渐成为现代水产病原体检测的首选.在众多分子生物学检测方法中,尤以核酸等温扩增技术备受关注.本文对各种核酸等温扩增技术在水产病原体检测中的应用进行了综述,阐述了各种核酸等温扩增技术的原理,对比分析了各种核酸等温扩增技术的优劣,介绍了该技术在水产病原体检测中的应用现状,展望了该技术的发展趋势,旨在促进我国水产病原体现场快速检测技术的发展.
关键词：
核酸等温扩增 水产病原体 快速检测
[期刊] 华北农学报
[作者]
许紫建 杨兵 苏霞 周宏专 史爱华 徐福洲
首先根据空肠弯曲菌mapA基因序列设计LAMP引物,建立检测空肠弯曲菌的LAMP检测方法。继而对LAMP方法中不同反应组分的浓度分别进行筛选,结果显示,当内外引物浓度分别为1.6,0.2μmol/L、Mg2+浓度为8mmol/L、dNTP浓度为1.4 mmol/L、Betaine浓度为0.8 mol/L时获得最佳的反应结果。最后对LAMP反应的特异性和敏感性进行检测,特异性检测结果显示,对其他13种革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌扩增结果均为阴性;敏感性检测结果显示,对空肠弯曲菌基因组DNA的检测限为每个反应管100 fg,对空肠弯曲菌培养菌液检测限为每个反应管7.5cfu。试验建立的LAMP方法为...
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