【目的】分析玉米2个光敏色素A基因(ZmPhyA1和ZmPhyA2)的蛋白结构及可能存在的功能区段,明确其响应于不同光线处理的表达模式。【方法】通过RT-PCR方法获得ZmPhyA1和ZmPhyA2编码的完整cDNA序列,推断2个基因编码蛋白的保守结构域,利用酵母双杂交测试其结构域间的物理互作,利用半定量RT-PCR技术分析不同光处理条件下ZmPhyA1和ZmPhyA2的表达模式。【结果】遗传进化树分析表明,ZmPHYA2与高粱光敏色素A的遗传关系要比与ZmPHYA1更近。ZmPHYA1与ZmPHYA2蛋白中含有1个GAF结构域、1个Phytochrome结构域、2个PAS结构域、1个HisK...

【目的】克隆玉米ZmBTF3b并研究其参与逆境反应的分子机制,为揭示玉米抗逆分子机制奠定基础。【方法】应用生物信息学方法分析ZmBTF3b启动子序列特点;应用酵母单杂交方法验证该基因编码转录因子的转录激活活性;应用实时荧光定量PCR方法分析ZmBTF3b在玉米不同组织中的表达差异及其在非生物胁迫下的表达模式。【结果】从玉米抗旱自交系CN165中克隆得到干旱诱导表达基因ZmBTF3b,该基因编码蛋白含有169个氨基酸,具有新生多肽复合体(nascent polypeptide-associated complex,NAC)保守结构域;酵母单杂交试验证明ZmBTF3b具有转录激活功能;实时荧光定量...

【目的】克隆黄曲条跳甲保幼激素诱导蛋白(Juvenile hormone-inducible protein,Ps-jhip-1)基因,并分析其表达特征。【方法】克隆黄曲条跳甲Ps-jhip-1基因,对其进行系统发育分析,并对其编码蛋白进行生物信息学分析。利用荧光定量PCR方法分析Ps-jhip-1基因在黄曲条跳甲不同组织器官及1个生物钟周期内表达量的变化趋势。【结果】成功克隆了Ps-jhip-1全长cDNA,其长度为1 252bp,开放阅读框为1 230bp,编码409个氨基酸。Ps-jhip-1基因编码蛋白具有典型的类蛋白激酶C超家族的蛋白功能域,不具备保幼激素膜受体分子的特征。系统发育分...

抗菌肽是生物体内具有抗菌活性的一种小分子物质,在昆虫细胞抵御外源微生物的感染过程中发挥着重要作用。为研究家蚕抗菌肽基因克隆、重组抗菌肽的表达和纯化方法,以家蚕中肠组织总RNA为模板,设计4对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增BmCecropin、BmCecropin B6、BmCecropin D和Bmmoricin这4种抗菌肽基因,通过自诱导方式原核表达4种抗菌肽重组蛋白,并对4种抗菌肽重组蛋白进行Ni-NTA亲和层析和超滤纯化。结果表明,克隆的BmCecropin、BmCecropin B6、BmC

为研究冷诱导结合蛋白(CIRP)在大黄鱼低温适应过程中的作用,采用同源克隆技术获得了大黄鱼CIRP基因,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了低温胁迫下大黄鱼各组织中CIRP基因的表达变化。结果显示,大黄鱼CIRP基因cDNA序列全长1211 bp,推测编码一个由182个氨基酸组成、分子量为19 ku的蛋白。序列比对显示硬骨鱼类CIRP基因序列较为保守,特别是N端的RNA识别基序(RRM)高度保守。系统进化树分析显示大黄鱼CIRP与银鳕相似性最高(81.5%),所有硬骨鱼类聚为一个大支。慢性

【目的】植物蛋白酶抑制剂是抵抗动物摄食和病原侵染的重要防御蛋白。玉米Wip1(wound-induced protein)基因属于Bowman-Birk蛋白酶抑制剂(BBI)家族,了解Wip1(wound-induced protein)的启动子活性和Wip1组织表达特性、受胁迫诱导表达情况和在不同受伤时间下的表达模式,为抗虫基因在植物中应用提供新信息。【方法】以玉米叶片组织的cDNA为模板,采用克隆测序技术获得Wip1启动子序列和该基因的cDNA序列。将所得启动子与植物表达载体p1300连接,构建重组表达载体p1300-Wip1-GUS,并采用冻融法将其转入农杆菌LBA4404中。利用农杆菌...

【目的】克隆受白粉菌诱导的小麦类萌发素蛋白基因,分析其在感、抗病单株中的表达模式,探讨其在小麦抗白粉病过程中的作用机制。【方法】根据基因芯片结果,结合电子克隆与RT-PCR方法,克隆到一个受白粉菌诱导的小麦类萌发素蛋白基因。通过中国春缺体-四体系对获得的基因片段进行定位。运用荧光定量PCR方法分析了该基因片段在抗病植株、感病植株白粉菌诱导的时空表达模式。【结果】获得了一个具有完整开放阅读框的小麦类萌发素蛋白基因片段,命名为TaGLP5(GenBank登录号为FJ594470)。系统进化分析表明该基因片段与已知的来自禾本科的萌发素蛋白分属不同的进化分支,很可能是新的小麦萌发素蛋白成员。通过中国春...

为探讨玉米AGPL2在籽粒发育时期淀粉积累过程中的功能机制,通过AGPL2基因克隆和构建带有GST标签的原核表达载体PGEX-6 T-1-AGPL2,并利用大肠杆菌诱导表达体系,用0. 5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在28℃条件下诱导表达6 h后,GST-AGPL2融合蛋白能够得到高水平表达,然后利用GST(Glutathione S-transferase)标签蛋白纯化介质进行亲和层析纯化,能够得到质量较高的GST-AGPL2融合蛋白;利用纯化所得的GST-AGPL2重组蛋白免疫新西兰大白兔制备了AGPL2多克隆抗体,分离并纯化抗血清,然后用rTEV Protease去除抗原GST-AGPL2融合蛋白的GST标签,并用纯化后的AGPL2多克隆抗体进行Western Blot检测,结果发现,AGPL2多克隆抗体具有较高特异性和灵敏性,可用于检测纳克级抗原蛋白;并利用Western Blot方法研究了AGPL2蛋白在玉米不同组织和不同授粉时期胚乳中的分布和表达模式,结果显示,AGL2蛋白在玉米不同组织中的表达具有组织特异性,且在胚乳中含量最高。AGPL2蛋白在玉米胚乳不同授粉时期表达量先增加后降低,且在授粉中期达到最大值。其结果与玉米籽粒发育过程中淀粉的积累规律一致,说明AGPL2主要存在于玉米胚乳中,且可能参与淀粉的合成,也说明AGPL2多克隆抗体具有很好的特异性,能够识别玉米体内的AGPL2抗原。

克隆猪胰岛素诱导１（ＩＮＳＩＧ１）基因，并对其蛋白质序列进行分析。根据人ＩＮＳＩＧ１基因的保守序列设计１对引物，以猪总ＲＮＡ为模板，经ＲＴ–ＰＣＲ获得ＩＮＳＩＧ１基因序列，通过相对荧光定量ＰＣＲ分析该基因在不同组织中的表达量；将ＩＮＳＩＧ１基因序列连接到ＰＭＤ１９–Ｔ ＳＩＭＰｌｅ载体上，用ＰＣＲ检测阳性克隆后测序，并对克隆得到的基因进行生物信息学分析。结果表明，ＩＮＳＩＧ１基因在肺中的表达量最高，其次是在肝脏，再次是在脾脏，在心脏中的表达量最低；通过克隆，获得了一段９９９ ｂＰ的序列，其中８３１ ｂＰ的开放阅读框编码２７６个氨基酸；该蛋白不含信号肽序列，与其他动物ＩＮＳＩＧ１基因氨基酸序列的．．．

【目的】克隆玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）小分子热激蛋白（small heat shock protein,sHSP）基因，分析其结构及在病菌发育和HT-毒素诱导过程中的表达模式。【方法】利用隐马尔可夫模型（hidden Markov model,HMM）筛选玉米大斑病菌全基因组范围内的sHSP家族成员，采用PCR技术克隆玉米大斑病菌01-23菌株的sHSP，通过生物信息学方法进行sHSP的理化性质分析、亚细胞定位、结构预测和系统发育分析，RNA-Seq和RT-qPCR分析sHSP在玉米大斑病菌不同发育阶段和HT-毒素诱导过程中的表达情况。【结果】从玉米大斑病菌基因组筛选到3个sHSP家族成员（StHSP37.2、StHSP37.0和StHSP22.6），克隆了01-23菌株中3个sHSP的DNA序列，编码的sHSP蛋白均属于弱酸、亲水蛋白，无跨膜结构域和信号肽；二级结构中无规则卷曲占58.97%—60.35%，而β-转角仅为2.69%—7.83%；亚细胞定位预测StHSP37.2和StHSP37.0位于细胞核，而StHSP22.6位于细胞核和细胞质；均含有近C端的ACD＿sHSP-like结构域，StHSP37.2、StHSP37.0和StHSP22.6分别有2、3和5个保守基序；利用SWISS-Model和AlphaFill构建了sHSP单体的三级结构模型；系统发育分析结果表明，StHSP22.6与链格孢（Alternaria alternata）、StHSP37.2和StHSP37.0与玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）的sHSP亲缘关系较近；玉米大斑病菌sHSP在菌丝中表达量最高，其次为芽管、附着胞和侵入钉，在分生孢子中表达量最低；StHSP22.6和StHSP37.2与玉米大斑病菌HT-毒素诱导显著负相关，在14 d时相对基因表达量分别上调6.45和18.12倍，21、28 d时StHSP37.2表达量仅上调2.56、1.78倍，而StHSP22.6表达量与WT无显著差异；StHSP37.0与HT-毒素诱导显著正相关，14、21和28 d时相对基因表达量分别下调59.23%、86.30%和88.11%；通过与玉米大斑病菌sHSP显著相关的表达基因挖掘，推测StHSP37.2和StHSP22.6主要与HSP90、HSP104、分解代谢及线粒体Mg2+转运有关，而StHSP37.0主要与液泡碱性氨基酸转运、有机合成和分泌有关。【结论】玉米大斑病菌sHSP家族成员既具有高度保守性，又与其他sHSP有结构和系统发育的差异性；不仅与玉米大斑病菌菌丝、芽管、附着胞和侵入钉发育相关，在HT-毒素诱导过程中也发挥重要调控作用。

应用电子克隆的方法获得了玉米的一个Pti1(Pto-interacting 1)同源基因的全长cDNA,命名为ZmPti1-1(Gen-Bank接受号为EF158035)。推断ZmPti1-1蛋白含有362个氨基酸,分子量为39.00 kDa,pI为8.14,包含蛋白激酶催化结构域保守的11个亚结构域。在水杨酸(Salicylic acid,SA)、甘露醇、氯化钠、脱落酸(Abscisic acid,ABA)和4℃低温的诱导下,ZmPti1-1在玉米幼苗叶片中的表达量明显上调。同时,在玉米不同发育时期、不同组织器官内,ZmPti1-1的表达水平也有很大差异,在子房中表达量最高,在雄蕊中检测不到...

【目的】克隆蛋白激酶C基因(PKC)及其启动子,验证该基因拷贝数,同时对PKC的表达规律进行研究,了解该基因在信号转导途径中的激活条件,为进一步研究该基因的功能奠定基础。【方法】首先通过简并引物PCR法获得PKC的同源片段,再利用Genome walking技术克隆片段的3′端和5′端侧翼序列,采用RT-PCR法扩增基因全长,并对基因结构和上游调控元件进行生物信息学分析。利用Southern blotting验证基因拷贝数。最后,利用半定量RT-PCR技术研究玉米大斑病菌在不同碳源、氮源培养以及非生物胁迫条件下,PKC的表达量的变化规律。【结果】获得PKC全长序列及其上游部分启动子区,生物信息...

用微机辅助设计合成了一对引物，用于扩增传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）中国地方株ＶＰ２基因片段。ＲＴＰＣＲ扩增出一１３２１ｂｐ的目的片段，分子杂交鉴定为ＶＰ２基因。扩增产物经双酶切后插入含噬菌体ＰＲＰＬ双强启动子的ｐＣＹＴＥＸＰ１表达质粒，构建了ＶＰ２基因克隆ｐＣＶＰ２１，经ＤｏｔＥＬＩＳＡ筛选出４个ＶＰ２表达阳性克隆。ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ显示有一约３２０００的目的蛋白带，且能与ＩＢＤＶ阳性血清结合。

越来越多的研究表明,非生物胁迫影响植物的生长发育与栽培范围。为了通过转基因方法提高栽培番茄、马铃薯对热和干旱组合胁迫的抗性,利用RT-PCR结合RACE技术,从热处理的烟草叶片中分离出了细胞质小分子热激蛋白基因。分析表明,该基因cDNA全长876 bp,包含一个480 bp的开放阅读框,编码159个氨基酸,相对分子量约为17.8 kDa,被命名为Nt-HSP17.8。Northern杂交结果显示,该基因在烟草中的表达不仅受单一胁迫如热或干旱的诱导,而且在干旱与热组合胁迫下表达量大大增加,说明该基因在耐热与干旱交叉胁迫中起重要作用。

【目的】克隆内蒙古白绒山羊AKT基因cDNA并分析其基本表达模式。【方法】RT-PCR克隆AKT基因cDNA。通过在线软件BLAST进行核酸序列分析,用SMART与Psite进行氨基酸序列分析。半定量RT-PCR检测AKT基因在绒山羊组织中的表达特异性。Western blotting检测绒山羊胎儿成纤维细胞中AKT表达。【结果】克隆到的内蒙古白绒山羊AKT基因cDNA片段长1 443 bp,包含了编码480个氨基酸残基的全长ORF,氨基酸序列与绵羊(NM_001161857.1)同源性为97%。SMART分析表明,ORF编码的蛋白包含了可与3-磷酸肌醇结合的PH结构域及具有丝氨酸/苏氨酸激酶...