[目的]探究磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/m TOR)信号通路在玉米赤霉烯酮(ZEA)诱导睾丸支持细胞(SC)自噬及影响SC细胞周期分布中的作用,揭示ZEA对雄性生殖毒性的机制。[方法]以Wistar大鼠原代睾丸支持细胞为材料,利用Western blot、流式细胞术和免疫荧光技术等方法检测PI3K/Akt/m TOR信号通路在ZEA对SC自噬及细胞周期分布的影响。[结果]随着ZEA浓度升高,PI3K/Akt/m TOR信号通路关键蛋白磷酸化水平显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01);加入PI3K抑制剂LY294002后,微管相关蛋白1轻链3(LC3)的荧光信号强度显著增强,荧光聚点更加明显(P<0.05或P<0.05或P<0.05),且细胞周期关键激酶Cdc2的活性显著增加(P

[目的]本文旨在探讨玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)对睾丸支持细胞(Sertoli cells,SC)乳酸产生的影响,[方法]以Wistar大鼠SC为研究材料,采用不同浓度的ZEA(0、0.1、1、10、20、30μmol·L~(-1))处理24 h,利用乳酸脱氢酶(LDH)释放检测试剂盒检测ZEA对SC的毒性作用;乳酸测试盒检测ZEA对SC内、外乳酸产生的影响;丙酮酸测试盒检测ZEA对SC内丙酮酸产生的影响; Western blot检测SC乳酸代谢通路相关蛋白的表达;免疫荧光法检测乳酸产生关键酶LDH荧光强度的改变。[结果]随着ZEA浓度的增加,ZEA对SC的细胞毒性逐渐增大(P<0.01);与对照组相比,染毒组细胞内、外乳酸含量和细胞内的丙酮酸含量显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01),葡萄跨膜糖转运蛋白1(GLUT1)和乳酸脱氢酶(LDH)在1、10、20、30μmol·L~(-1)ZEA染毒组的蛋白表达量极显著降低(P<0.01);单羧酸转运蛋白4(MCT4)在30μmol·L~(-1)ZEA染毒组的蛋白表达量呈显著降低(P<0.05);免疫荧光检测结果表明,LDH的荧光强度随着染毒浓度增加而降低,与对照组相比,10、20、30μmol·L~(-1)ZEA染毒组细胞内的蛋白表达量均极显著下降(P<0.01)。[结论]ZEA可以抑制SC乳酸产生,干扰SC对生殖细胞的能量供应,进而对雄性生殖功能产生损伤。

【目的】探究姜黄素（Cur）对玉米赤霉烯酮（ZEA）诱导猪肾上皮细胞（PK-15）氧化损伤的保护作用，并基于SIRT1/FOXO1信号通路阐明其作用机制，为姜黄素的兽医临床应用提供依据。【方法】试验分为5组：对照组、ZEA组（36.55μg·mL~(-1) ZEA）、Cur 6.25组（36.55μg·mL~(-1) ZEA+6.25μmol·L~(-1) Cur）、Cur 12.5组（36.55μg·mL~(-1) ZEA+12.5μmol·L~(-1) Cur）、Cur 25组（36.55μg·mL~(-1) ZEA+25μmol·L~(-1) Cur）；通过MTT法测定ZEA的半数抑制浓度和Cur对PK-15细胞的最大安全浓度；使用倒置显微镜观察PK-15细胞的形态变化；采用试剂盒检测细胞内活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）以及丙二醛（MDA）的水平；qRT-PCR检测细胞SIRT1、FOXO1、CAT、Mn-SOD的mRNA水平；Western Blot检测SIRT1、FOXO1和Acetyl-FOXO1蛋白的表达量。【结果】ZEA的IC_(50)为36.55μg·mL~(-1),Cur的最大安全浓度为25μmol·L~(-1)；与对照组相比，ZEA极显著降低PK-15细胞活力（P<0.01），极显著提高ROS和MDA水平（P<0.01），极显著降低SOD、CAT活性（P<0.01）；与ZEA组对比，不同浓度的Cur(6.25、12.5、25μmol·L~(-1)）显著提高PK-15细胞的存活率（P<0.05），改善细胞形态；极显著（P<0.01）降低ZEA诱导的ROS和MDA水平；极显著升高细胞内SOD和CAT活性（P<0.01）。与ZEA组对比，各Cur组不同程度的升高SIRT1和CAT的mRNA表达量，极显著的降低FOXO1的mRNA表达量（P<0.01）；极显著升高Mn-SOD的mRNA表达量（P<0.05），极显著升高Acetyl-FOXO1蛋白表达（P<0.01）；与ZEA组对比，各Cur组均极显著升高SIRT1蛋白表达（P<0.01），极显著降低Acetyl-FOXO1蛋白表达（P<0.01）。【结论】Cur可以上调SIRT1的表达，降低FOXO1的乙酰化水平，诱导抗氧化酶Mn-SOD和CAT的表达，从而清除ROS，降低MDA水平，减轻ZEA对PK-15细胞的氧化损伤作用。

为探究连翘酯苷A（FA）对玉米赤霉烯酮（ZEA）诱导的猪肾上皮细胞（PK-15）凋亡的影响及其可能的保护机制，体外培养PK-15细胞，经36.55 μg·mL~(-1 )ZEA和不同浓度（31.25、62.5、125 μg·mL~(-1)）FA处理24 h，通过噻唑蓝（MTT）法测定细胞存活率；通过Hoechest 33342活细胞染色在荧光显微镜下观察细胞凋亡情况；利用试剂盒检测细胞上清液中的乳酸脱氢酶（LDH）活性和活性氧（ROS）水平；利用实时荧光定量PCR测定细胞中的Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的mRNA表达水平。结果表明：浓度在125 μg·mL~(-1)以下的FA可以提高PK-15细胞存活率；FA能显著提高经ZEA处理的PK-15细胞存活率，且能显著降低经ZEA处理的细胞上清液中的LDH活性，抑制ZEA引起的ROS的生成；ZEA能显著升高Bax、Caspase-8、Caspase-3和Caspase-9 mRNA的表达量，Bcl-2 mRNA的表达量显著降低；不同浓度的FA能不同程度地提高Bcl-2 mRNA的表达量，降低Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA的表达量。上述结果说明ZEA会诱导PK-15细胞发生凋亡，但FA可通过抑制内源性凋亡途径和氧化应激反应抑制细胞凋亡，从而起到保护作用。

[目的]本文旨在探究玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)对湖羊睾丸间质细胞(leydig cells, LC)的毒性作用。[方法]用200μmol·L~(-1) ZEA处理湖羊LC 8 h,通过EdU法检测细胞增殖情况，RT-qPCR和Western blot分别检测与细胞增殖和凋亡、氧化应激、m~6A甲基化修饰相关基因和蛋白的表达变化。[结果]与对照组相比，ZEA处理组LC活性和增殖数量极显著下降(P<0.01);细胞增殖相关基因pcna及其蛋白表达水平均极显著下降(P<0.01);促凋亡基因表达水平(bax、caspase3,P<0.01;tp53、caspase9,P<0.05)均显著升高，相对应蛋白表达水平(TP53、CASPASE9,P<0.01)极显著升高；抗凋亡基因bcl-2及蛋白表达水平显著降低(P<0.05);氧化应激相关基因相对表达水平(cat,P<0.05;gsh-px、sod2,P<0.01)显著或极显著上升，其相关蛋白表达水平(SOD2,P<0.01)极显著上升；m~6A相关基因alkbh5的相对表达水平显著降低(P<0.05),mettl3和ythdc1水平极显著升高(P<0.01),ythdf3水平显著升高(P<0.05)。[结论]ZEA可抑制湖羊LC增殖，促进湖羊LC凋亡，导致LC发生氧化损伤，产生毒性作用，且其毒性作用可能跟m~6A甲基化修饰相关。

[目的]本文旨在探究玉米赤霉烯酮（zearalenone， ZEA）对湖羊睾丸间质细胞（Leydig cells， LCs）的毒性作用。[方法]试验采用湖羊LCs为试验材料，用200 μmol·L~(-1) ZEA 处理8 h，通过Edu法检测细胞增殖情况，qRT-PCR 和Western blot分别检测与细胞增殖和凋亡、氧化应激、m~(6)A甲基化修饰相关基因和蛋白的表达变化。[结果]与对照组相比，ZEA处理组LCs细胞活性和细胞增殖数量极显著下降（P＜0.01）；细胞增殖相关基因pcna相对表达量及其相关蛋白表达水平极显著下降（P＜0.01）；促凋亡基因相对表达量升高（bax、caspase3，P＜0.01；tp53、caspase9，P＜0.05），其相关蛋白表达水平升高（TP53、CASPASE9，P＜0.01）；抗凋亡基因bcl-2相对表达量及其相关蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；氧化应激相关基因相对表达量上升（cat，P＜0.05；gsh-px、sod2，P＜0.01），其相关蛋白表达水平上升（SOD2，P＜0.01）；m~(6)A相关基因的相对表达量alkbh5显著降低（P＜0.05）、mettl3和ythdc1极显著升高（P＜0.01）、 ythdf3显著升高（P＜0.05）。[结论]ZEA可抑制湖羊LCs增殖、促进湖羊LCs凋亡，导致LCs发生氧化损伤，产生毒性作用，且其毒性作用可能跟m~(6)A甲基化修饰变化相关。

【目的】在骨骼肌生长或损伤刺激下,骨骼肌卫星细胞被激活、增殖分化形成肌管,促进骨骼肌的生长发育或修复组织创伤。FoxO1负调控骨骼肌的生成,但在骨骼肌卫星细胞分化过程中的作用未见报道。因此,笔者探索FoxO1对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响,希望为深入研究FoxO1调控骨骼肌生长发育的作用机理奠定基础。【方法】以1—3日龄健康大白猪为材料,采用单根肌纤维法分离培养猪骨骼肌卫星细胞,接种第2天、第4天和第6天在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。在细胞分化第8天,用免疫荧光染色方法染肌管,DAPI染核,并在荧光倒置显微镜下观察拍照。待细胞汇合至70%—80%时,将培养基换成含50 nmol·L-1渥曼青...

旨在探究羊口疮病毒ORFV118蛋白对山羊睾丸支持细胞周期、凋亡以及诱导机体免疫应答相关的4种细胞因子(IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α)表达水平的影响。在ORFV118基因克隆基础上，成功构建真核表达载体pEGFP-ORFV118;将pEGFP-ORFV118转染山羊睾丸支持细胞，Western Blot鉴定ORFV118蛋白表达的正确性；流式细胞仪检测ORFV118基因对细胞周期及凋亡的影响；RT-qPCR检测细胞周期相关基因CDK2和P21、凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase7、P53和BCL2L11的mRNA的表达水平，并利用RT-qPCR和ELISA方法检测免疫相关的细胞因子表达的变化。结果显示，成功扩增ORFV118基因，全长为309 bp。ORFV118蛋白的表达阻滞了细胞的DNA合成期(S期),促进了DNA合成后期(G2/M期)且下调基因CDK2的mRNA表达水平；可抑制细胞的凋亡作用，且下调促凋亡基因Caspase3、Caspase7、SOCS2的mRNA表达水平；对细胞因子IL-1β和IFN-γ呈不同程度的抑制作用，而对IL-6和TNF-α呈促进作用。

按毒理学方法给小鼠灌喂不同剂量喹乙醇,采用原位末端标记法检测该药物饲料添加剂对生精细胞凋亡作用的影响。结果表明:各试验组小鼠生精细胞凋亡指数较正常组和阴性对照组均有所增加,在不同时间,高剂量组均表现差异显著(p<0.05)或极显著(p

【目的】分析他克林对脂多糖(LPS)诱导小鼠睾丸支持细胞(TM4)炎性损伤的保护作用，从炎症角度探索他克林的功能，为动物生产过程中雄性动物生殖疾病相关抗炎药物的利用及精子质量提升提供更多药物选择。【方法】采用CCK8法检测0.01、0.10、1.00、10.00和100.00 μg/mL LPS分别诱导3.0、6.0、12.0和24.0 h对TM4的适宜损伤条件；同时分析0.01、0.10、1.00、10.00、100.00、1000.00、10000.00和100000.00 μg/mL他克林在加入LPS前预处理0.5、1.0和2.0 h或加入LPS后处理0.5、1.5、3.0、6.0、12.0和24.0 h对TM4炎性损伤的适宜保护条件。以荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测TNF-α和IL-6基因mRNA表达水平，以ELISA法进一步评价细胞上清TNF-α和IL-6蛋白表达量，以免疫蛋白印迹(WB)法分析NF-κB蛋白表达量。【结果】不同浓度不同处理时间下，LPS对TM4增殖的影响情况存在差异，其中1.00 μg/mL LPS处理12 h TM4的增殖率极显著低于空白组（P0.05）。【结论】0.01 μg/mL他克林后处理6.0 h对TM4的保护作用最佳，其机制可能与IL-6和TNF-α基因mRNA及蛋白表达量下调有关。

采用Ⅴ型胶原酶单次振荡消化法和低渗处理,及差速贴壁和免疫组化染色法,对大鼠睾丸支持细胞进行分离、纯化和鉴定。结果表明,该分离纯化方法对睾丸支持细胞损伤较小,获得的细胞活性较高,原代细胞存活率为85%,且无较大细胞团,接种后增殖迅速,并在第8天达到最高峰;细胞产率为6.5×105/g;绝大多数细胞呈F as-L阳性,细胞纯度可达95%;细胞核仁清楚,核仁周围可见着色较深的卫星核小体。

为了建立体外模拟氧自由基诱导的细胞氧化损伤模型,本试验采用Percoll密度梯度离心法纯化原代大鼠Leydig细胞,并鉴定特异性蛋白3β-HSD;采用MTT法测定细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率、线粒体膜电位、ROS以及O·-2含量,比色法测定·OH、MDA的含量以及抗氧化物酶SOD、CAT和POD的活性。结果显示:特异性蛋白3β-HSD鉴定后,荧光显微镜观察到大部分细胞呈现特异性荧光。MTT测定结果显示,300~1 000μmol·L-1H2O2处理细胞均可极显著降低细胞活力(P<0.01);300μmol·L-1H2O2处理可显著提高Leydig的凋亡率以及增加ROS含量(P<0.05)...

旨在探索不同浓度玉米赤霉烯酮(ZEN)对奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)生长和乳脂合成相关基因表达的影响。首先，用不同剂量ZEN处理MAC-T细胞36 h,血细胞计数板统计细胞数量，染色并分析细胞凋亡与坏死情况，筛选ZEN添加的合适剂量；接着，试剂盒检测ZEN对MAC-T细胞中活性氧(ROS)以及线粒体膜电位的影响；最后，利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术，分析ZEN对MAC-T细胞增殖、凋亡、氧化应激和乳脂合成相关基因表达的影响。结果表明，低剂量ZEN(0.01～1.00μmol/L)有促进MAC-T生长的趋势，而高剂量ZEN(5.00～10.00μmol/L)显著降低MAC-T细胞数量；0.10μmol/L ZEN对MAC-T中ROS和线粒体数量无明显影响，但10.00μmol/L ZEN显著增加了MAC-T中ROS水平，降低了线粒体数量；RT-qPCR结果表明，0.10μmol/L ZEN显著促进增殖基因(CDK1、CCND2)、抗氧化基因(DHODH、GPX4)和抗凋亡基因(BCL-2)表达，但同时提高了凋亡基因(CAS-3、BAX)表达量；10.00μmol/L ZEN显著抑制增殖基因(PCNA、CDK1、CCND2)、抗氧化基因(DHODH、GPX4、AIFM2)和抗凋亡基因(BCL-2)表达，但显著促进凋亡基因(CAS-3、BAX)表达；值得注意的是，0.10μmol/L ZEN显著促进了乳脂合成相关基因(PPARγ、FASN、JAK-2),但10.00μmol/L ZEN显著抑制了这些基因表达。上述结果提示，不同浓度ZEN对MAC-T细胞的作用存在差异：0.10μmol/L ZEN可以促进MAC-T细胞生长和乳脂合成相关基因表达的同时，也会诱导凋亡基因表达；10.00μmol/L ZEN会诱导MAC-T细胞氧化应激、降低线粒体数量，抑制增殖、抗氧化、抗凋亡和乳脂合成相关基因表达，同时促进凋亡基因表达，导致细胞死亡。

[目的]本试验旨在建立一个实时追踪山羊细胞自噬发生状况的工具,以探讨细胞自噬对睾丸支持细胞(SC)和生殖细胞的影响。[方法]通过PCR法扩增mCherry-EGFP-LC3基因序列1 884 bp,将其导入真核表达载体pEX-3中,得到重组质粒pmCherry-EGFP-LC3;将pmCherry-EGFP-LC3及对照质粒p EX-3分别转染体外分离培养的山羊SC,饥饿处理12 h后用荧光显微镜观察融合蛋白在细胞中的表达,用RT-qPCR和Western blot检测细胞中自噬相关基因和蛋白表达变化,用

【目的】探讨体外培养条件下,LiCl诱导大鼠脂肪基质细胞向成骨细胞分化的潜能。【方法】采用Ⅰ型胶原酶消化组织块法分离获得大鼠脂肪基质细胞,将其分为处理组和对照组,分别用25 mmol/L LiCl和25mmol/L NaCl处理3周,采用形态学、SQ RT-PCR、免疫荧光染色、碱性磷酸酶染色及茜素红染色等方法,检测大鼠脂肪基质细胞向成骨细胞分化的能力。【结果】大鼠脂肪基质细胞在LiCl诱导24 h后,细胞形态由成纤维样变成方块状;诱导3周后,SQ RT-PCR检测发现,细胞表达碱性磷酸酶(AP)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)和骨γ羧基谷氨酸(Bglap)等成骨细胞特异性基因,与处理0 d相比,差异达...