【目的】玉米孢囊线虫（Heterodera zeae）为孢囊线虫属定居型半内寄生线虫，可侵染多种禾本科作物的根部，玉米孢囊线虫的发生和传播扩散将会对我国玉米生产造成严重威胁。本研究旨在建立玉米孢囊线虫的快速分子检测体系，以期从近缘属种可以准确地检测出玉米孢囊线虫，为玉米孢囊线虫的监测预警和防控打下技术基础。【方法】从我国河南、河北、甘肃、山东、湖南、广西和北京共收集20个玉米孢囊线虫近缘属种群体作为供试线虫；选取13条含有10个碱基的随机引物，采用RPAD技术对供试孢囊线虫进行多态性分析，筛出玉米孢囊线虫特异性RPAD片段，并将其转化为玉米孢囊线虫SCAR-PCR引物；采用PCR方法测试玉米孢囊线虫特异性引物的准确性以及检测技术体系的稳定性、灵敏度和实效性。【结果】通过RAPD比对分析，发现随机引物OPA03能在玉米孢囊线虫基因组DNA中扩增出一条468 bp的特异性片段；将该片段回收测序，根据片段序列信息，利用Primer 5.0设计一对特异性引物HzF1/HzR1；特异性检测结果表明，HzF1/HzR1仅在玉米孢囊线虫群体中扩增出大小为393 bp的特异性片段，其他5种16个孢囊群体（禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、大豆孢囊线虫、旱稻孢囊线虫和甜菜孢囊线虫）和4个其他种群（水稻干尖线虫、马铃薯腐烂茎线虫、落选短体线虫和咖啡短体线虫）均没有扩增出目的条带；以含有玉米孢囊线虫的混合种群孢囊DNA为模板时，特异性引物HzF1/HzR1也能扩增出来单一明亮的393 bp的特异片段，而不含玉米孢囊线虫的混合种群不能扩增出该片段；该体系实现了玉米孢囊线虫准确、稳定的检测目的；对建立的玉米孢囊线虫快速检测技术体系灵敏度和实用范围测试，表明该检测体系对玉米孢囊线虫单个孢囊和单条幼虫均有灵敏的检测能力，检出值不低于1/2 000个孢囊和1/80条2龄幼虫。【结论】本研究建立的玉米孢囊线虫SCAR-PCR快速分子检测技术，可用于玉米孢囊线虫单一样本和混合种群的快速检测，对玉米孢囊线虫的孢囊和2龄幼虫均有灵敏的检测能力，检测引物特异性强，检测方法便捷稳定，灵敏度高。

【目的】建立从禾谷孢囊线虫及其近缘种的混合群体中检测禾谷孢囊线虫的快速分子检测方法。【方法】使用随机扩增多态性DNA(RAPD)和特征序列扩增区域(SCAR)标记的方法,运用PCR技术进行特异性检测。【结果】用本研究建立的SCAR标记快速分子检测体系对9种32个线虫种群进行检测,能够直接从混合线虫样品中检测出禾谷孢囊线虫。该检测方法对禾谷孢囊线虫的孢囊、2龄幼虫具有扩增能力,最低检出阈值为1/2000个孢囊,1/80头2龄幼虫。【结论】本研究设计的SCAR标记快速分子检测体系能够从禾谷孢囊线虫及其近缘种的混合种群中快速检测出禾谷孢囊线虫,且检测准确、灵敏度高。

根据旱稻孢囊线虫(Heterodera elachista)和常见孢囊线虫的ITS序列比对分析,设计1对旱稻孢囊线虫特异性引物He–F/He–R,特异性片段长度为281 bp。运用该特异性引物及建立的DNA提取方法和PCR体系,可特异性检测旱稻孢囊线虫单条2龄幼虫,可以从混合有1条旱稻孢囊线虫的0.1 g水稻根组织中特异性检测出目的DNA片段。特异性引物He–F/He–R与通用引物D2A/D3B结合,运用一步双重PCR检测方法可快速鉴定单孢囊,也可从初始分离的田间土壤总线虫样品中直接检测出旱稻孢囊线虫。

将松材线虫RAPD特异片段OPM05-X2100进行分离、回收,与载体pGEM-TVector连接,转化大肠杆菌并培养,对目标克隆测序。根据测序结果,用Oligo5.0软件设计引物,正向引物为M05F2(5'-CGGGT CATGG CTGGA GGTAT CGT-3'),反向引物为M05R1(5'-TGGCT CAATG GCAAA TCCTT CGTA-3'),成功地将松材线虫特异片段OPM05-X2100通过引物对M05F2/R1转化为SCAR-M05-X600。运用SCAR标记引物M05F2/R对枯死松树体内分离的92份线虫样本的DNA进行标记,并对单条线虫经简易方法提取的DNA进行...

【目的】设计禾谷孢囊线虫（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ａｖｅｎａｅ）和菲利普孢囊线虫（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｆｉｌｉｐｊｅｖｉ）特异性引物，建立同步快速检测这两种线虫的双重ｐＣｒ体系，为中国小麦孢囊线虫（Ｃｅｒｅａｌ Ｃｙｓｔ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ，ＣＣｎ）的田间快速诊断与综合治理提供技术支持。【方法】通过比对分析１０种植物寄生线虫２４个群体的线粒体ｄｎａ（ｍｔｄｎａ）Ｃｏｉ序列，分别设计并筛选禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的上游特异性引物Ｈａ ｆ８和Ｈｆ ｆ９，以及下游通用引物Ｈａｆ ｒ８；通过引物浓度比和退火温度的优化，建立针对这两种ＣＣｎ的双重ｐＣｒ检测体系；利用该体系对中国黄淮麦区部分ＣＣｎ样品．．．

【目的】建立巢式PCR方法，快速检测处于病害潜育期的玉米叶片内的多堆柄锈菌（Puccinia polysora），为玉米南方锈病（southern corn rust）的预测和防治提供技术支持。【方法】根据多堆柄锈菌ITS区序列，在其变异区设计3条多堆柄锈菌特异性检测引物NX471-F、NX255-F和NX255-R，建立以NX471-F与真菌ITS区通用引物ITS4为外侧引物，NX255-F/NX255-R为内侧引物的巢式PCR。采用20μL扩增体系：Ex Taq DNA聚合酶（5 U·μL~(-1))0.15μL、10×Ex Taq Buffer(Mg~(2+)plus)2μL,d NTP Mixture（各2.5 mmol·L~(-1))1.6μL，上下游引物（10μmol·L~(-1)）各0.3μL,DNA 1μL,14.65μL ddH_2O。扩增程序：利用外侧引物NX471-F/ITS4进行第一步PCR扩增，95℃预变性7 min;95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,30个循环；72℃再延伸7 min。将扩增后的产物稀释20倍，取1μL用作第二步PCR的扩增模板，然后以内侧引物NX255-F/NX255-R进行第二步PCR扩增，95℃预变性7 min;95℃变性30 s,66℃退火30 s,72℃延伸26 s,30个循环；72℃再延伸7 min。同时选用内侧引物进行常规PCR扩增，扩增体系同巢式PCR，扩增程序除循环数为38，其余程序同巢式PCR的第二步PCR检测。在此条件下对多堆柄锈菌、高粱柄锈菌（Puccinia sorghi）、青杨叶锈病菌（Melampsora laricipopulina）和7种玉米常见病原菌进行特异性检测，对不同梯度多堆柄锈菌基因组DNA和3种人工接种病叶进行灵敏度检测。【结果】巢式PCR检测体系仅在检测多堆柄锈菌时，产生了255 bp的目的条带，其他菌株均未扩增出目的条带。巢式PCR检测体系对多堆柄锈基因组DNA的最低检测限为10 fg·μL~(-1)，是常规PCR检测体系灵敏度的500倍。当1 g人工接种病叶含500—2.5×10~4个多堆柄锈菌夏孢子时，常规PCR和巢式PCR检出阳性率分别0和85.71%，巢式PCR可检测出的夏孢子个数最少为1 000个；当1 g人工接种病叶中含1—7个夏孢子堆时，常规PCR和巢式PCR检出阳性率分别76.19%和100%，常规PCR可检测出的夏孢子堆个数最少为2个，巢式PCR可检测出1个及以上夏孢子堆；当1 g人工接种病叶中含1—7个侵染点时，常规PCR和巢式PCR检出阳性率分别14.29%和66.67%，检测出的侵染点个数最少分别为6个和3个。【结论】成功建立了一种以NX471-F/ITS4为外侧引物，NX255-F/NX255-R为内侧引物的巢式PCR检测方法，可快速、高效、准确检测玉米叶片中潜伏期的多堆柄锈菌。

根据转基因玉米品系NK603外源插入片段与玉米基因组序列设计品系特异性引物,建立转基因玉米品系NK603的品系特异性环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对此方法进行灵敏度、特异性测试。试验表明该方法能够快速检测出转基因玉米NK603品系成分,检测灵敏度为0.1%,并具有较高的特异性和较好的稳定性。

为建立快速鉴定玉米南方锈病菌和玉米普通锈病菌的分子检测方法,有助于玉米锈病的早期预警和有效防控,利用真菌ITS通用引物分别对采自海南、河南、吉林的玉米锈病菌样品进行了rDNA-ITS区克隆和测序分析(GenBank登录号为:HM452902,HQ154021HQ154038),并根据其变异区段序列分别设计了病原菌检测特异性引物。结果表明:设计的检测引物具有较高的种特异性和检测灵敏度,在普通PCR体系中可检测到南方锈病菌和普通锈病菌的锈病菌DNA的最低浓度分别为100和1pg/μL。本研究建立的检测体系对2

利用本研究筛选出的一对松材线虫特异性PCR引物(上游引物:5′-CTACGTGCTGTTGTTGAGTTGGC-3′,下游引物:5′-TGGTGCCTAACATTGCGCGA-3′),从松材线虫DNA中,扩增出一条长度403bp(基因库登陆号:DQ855275)的特异性DNA片段。该引物可以将松材线虫DNA与松墨天牛组织以及拟松材线虫、畸刺伞滑刃线虫、变异伞滑刃线虫、小角伞滑刃线虫、利昂伞滑刃线虫、湖南伞滑刃线虫、红松滑刃线虫、滑刃属线虫、斯坦纳长尾线虫、小茎线虫、剑尾齿杆双胃线虫和寄生小杆属线虫等12种线虫的DNA区分开来。在此基础上,建立一套利用PCR技术直接从受感染的松墨天牛组织中检测出...

运用PCR技术,实现了对相似穿孔线虫单条虫ITS区域的扩增,通过基因测序以及与GenBank中rDNA序列的比较,结果显示GFCh、HANh、GZll和GZlbs 4个种群的序列与GenBank中Radopholus similisThrone序列具有高度同源性。聚类分析表明,这4个种群可能有着不同的地理来源。

为检验已开发的SCAR标记与实时PCR两种分子检测方法鉴定松材线虫的可靠性,本文选用线虫未知种样品7个以及已知种样品3个为实验材料,采用上述两种分子检测方法进行检测,并且对7个线虫未知种样品进行形态鉴定。结果表明:1)运用SCAR标记检测,第2、3、4、7号4个未知种样品与8号松材线虫样品出现了一条清晰、明亮的860bp特异条带,第1、5、6号样品与9号拟松材线虫、10号大核滑刃线虫均未出现扩增谱带,表明第2、3、4、7号4个待测样品中含有松材线虫,而第1、5、6号3个待测样品中不含有松材线虫;2)运用实时PCR检测,第2、3、4、7号4个样品与8号松材线虫样品表现有明显的阳性扩增信号,其余样...

为了获取准确、快速检测松材线虫的方法,利用纤维素酶活性、苯乙酸与苯甲酸含量和显色剂检测松材线虫的方法进行了比较研究.纤维素酶活性检测结果为病树与健树酶活性差异显著.病树的光吸收值与健树的光吸收值差异不显著,但测定结果不稳定.显色剂测定病树内与健树内的显色差异明显,病树的显色结果呈深红色至浅红色,线虫愈多色泽愈深;健康材呈无色,感染拟松材线虫的松材呈清白色或无色.显色剂检测是简单、快速和有应用价值的方法.

禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是真菌性玉米茎基腐病的主要致病菌之一,为了减少种子带菌对该病害的传播,本研究采用巢式PCR技术构建玉米种子检测体系,并对其进行特异性、灵敏度和可行性检测。结果表明,该体系可有效检测到玉米(Zea mays)种子携带禾谷镰刀菌的情况,灵敏度达4.224 pg·μL-1,是一种快速、灵敏、特异性强的检测体系,为玉米茎基腐病种子带菌检测、早期诊断和及时防治提供技术支持和理论依据。本研究是运用巢式PCR技术检测玉米茎基腐病主要致病菌-禾谷镰刀菌在国内的首次报道。

本试验针对已商品化的转基因大豆、玉米和水稻的主要外源基因Cry1A(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因和PAT基因及共有的内标准基因RBCL基因设计了10对引物,对从超市购买的进口大豆、玉米和水稻的11种深加工制品(未标注是否含有转基因成分)进行了五重巢式PCR定性检测。第1轮普通五重PCR检测,11个待测样品均未出现任何转基因成分,其灵敏度为0.5%;第2轮将普通五重PCR扩增产物进行五重巢式PCR检测,结果在卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品和婴儿米粉中扩增出RBCL基因,玉米淀粉和玉米泥中扩增出RBCL基因、Cry1A(B)基因和PAT基因;玉米蛋白粉扩增出RBCL基因、Cry1...

利用通用引物扩增了玉米细菌性枯萎病菌及其近似种的转录间隔区并进行了序列测定。通过序列比较,设计了一对玉米细菌性枯萎病菌的专化性引物,并对所有参试菌株进行扩增。结果显示:该对引物能从参试的玉米细菌性枯萎病菌中特异性地扩增出1条299bp的条带,而其他参试菌株没有扩增信号。与扩增细菌ITS区域的通用引物结合使用,建立了检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌的巢式PCR技术,其检测灵敏度可达到4个细菌细胞,可以准确、灵敏地检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌。