【目的】建立高效的玉米大斑病菌REMI遗传转化体系,进而利用该技术创制突变体,为克隆病菌生长发育和致病性相关的基因奠定基础。【方法】摸索玉米大斑病菌原生质体制备的菌龄、酶系统及酶解条件、原生质体收集方式、转化子最适潮霉素B筛选浓度以及转化使用的质粒,建立该病菌高效的REMI转化体系;利用PCR技术对潮霉素B抗性转化子进行筛选并对部分突变体进行分析。【结果】培养20 h的幼嫩菌丝,用浓度分别达到1.25%的Lyallzyme、Snailase和Drislase 3种酶混和液酶解4 h、离心速度为3 000 r/min时原生质体产量最大;当潮霉素B浓度为50μg·mL-1时,野生型菌株的分生孢子萌...

【目的】利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化技术,对玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)进行转化,构建ATMT突变体库,为从分子水平上揭示病菌的致病机理奠定基础。【方法】以带有重组双元载体的农杆菌对玉米大斑病菌进行转化,利用潮霉素B进行筛选,对抗性稳定的转化子进行PCR检测,构建玉米大斑病菌ATMT突变体库;从突变体库中随机选取一定数量的突变体,对其菌落形态、菌丝及分生孢子发育、致病性等进行分析。【结果】获得了1 265株玉米大斑病菌T-DNA插入突变体;从中随机选取36株突变菌株,对其进行抗性筛选和PCR检测,发现潮霉素磷酸转移酶...

【目的】利用RNA干扰技术探讨玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因StPKS的功能。【方法】将玉米大斑病菌StPKS基因片段连接到pSilent-1载体中,构建StPKS的RNA干扰载体pSilent-StPKS1-2。利用聚乙二醇(PEG)介导的方法将之转入玉米大斑病菌野生型菌株01-23的原生质体中,通过潮霉素筛选得到转化子,采用半定量RT-PCR方法分析转化子中StPKS的表达情况,显微观察转化子与野生型菌丝形态的差异。【结果】本研究构建了StPKS RNA干扰载体并进行了成功转化,经潮霉素抗性筛选和PCR验证最终获得了9个阳性转化子,其中5个转化子菌落颜色变浅。对转化子进行半定量PCR分析发现...

为明确近年来中国玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)的生理小种变化和种群消长情况,分析玉米大斑病逐年加重的原因。采用常规Ht单基因(Ht1、Ht2、Ht3和HtN)鉴别寄主,对2005年和2006年采自黑龙江、吉林、辽宁、河北、山东、陕西、山西、河南、四川和北京-天津-唐山地区共10个省区28个地区的204个玉米大斑病菌菌株进行了生理小种鉴定;利用毒力频率法分析玉米大斑病菌的生理分化及其在中国的分布频率。结合前人研究结果,分析了近30年中国玉米大斑病菌生理小种变化趋势。共鉴定出0,1,2,3,12,13,23,123,23N共9个生理小种,其中0号小种和1号小种为优势小种,...

在玉米自交系4H8中发现一个叶色突变体,自然条件下,该突变体幼苗叶色呈淡绿色,生长明显缓慢,逐渐萎蔫死亡。利用出现淡绿色幼苗的自交系4H8杂合体以及其与绿色自交系40-6构建的一套分离群体对叶色淡绿色突变体进行了遗传分析,发现4H8的淡绿色基因由1个隐性核基因控制,初步命名为vl1(Virescent leaf 1),并用SSR分子标记将该基因初步定位在第1染色体的长臂上,位于SSR标记umc1323和umc1709之间,与二者的遗传距离分别为2.1 cM和10.3 cM。该研究结果为今后该基因的克隆和功能分析奠定了基础。

在玉米自交系Mo17的杂交后代中,发现了一份玉米矮杆突变材料,该突变材料表现为节间缩短、植株严重矮化、簇生、花器官发育异常。该突变株与不同核背景玉米自交系(Mo17、B73、B77和W22)杂交衍生的后代群体中,出现了矮杆株与株高正常株两种类型,矮杆株数与株高正常株数的比例为1∶1。分离群体中株高正常的植株自交,后代株高均正常。鉴于突变表型是在F1出现,同时结合多年多点田间表型调查的数据,初步推断该矮杆性状是由显性单基因控制。利用SSR分子标记,将该基因定位于玉米第2染色体上,为该基因的克隆工作奠定了基础。

【目的】研究玉米矮秆突变体的激素敏感性,从代谢水平解释它的矮化机理。【方法】以玉米矮秆突变体(掖478改良系的突变体)和3个野生型自交系(掖478、齐319、PH4CV)为材料,采用不同同质量浓度(50,100,150,200mg/L)赤霉素和生长素于苗期进行喷施处理,喷施后10,20,30d测定幼苗株高,分析该突变体的激素敏感性。【结果】100mg/L赤霉素和100mg/L生长素为最适激素质量浓度,处理后30d赤霉素和生长素对突变体株高的作用才能得以充分体现。在激素最适质量浓度、最佳观测时间下,赤霉素能

为建立一套全面的制备玉米大斑病菌完整染色体的制备体系,以玉米大斑病菌菌株F124为供试菌株,比较了冷冻液氮研磨法、直接包埋法、原生质体包埋法制备玉米大斑病菌完整染色体的效果。结果发现:使用直接包埋法不能从玉米大斑病菌中提取染色体;冷冻液氮研磨法得到的染色体是不完整的;原生质体法提取出了完整的染色体,是最适合制备完整染色体的方法。并且用原生质体法提取该菌株的染色体脉冲场电泳技术初步分离,首次得到了2条大于2200 kb的染色体条带。

采用2套Ht单基因鉴别品种,对2007-2009年采自云南省13个地区的81份玉米大斑病菌菌株进行了生理小种鉴定,利用分子标记技术对菌株交配型进行了分析。结果表明,云南省玉米大斑病菌生理小种和交配型组成复杂,81个菌株可分为0、1、2、3、12、23、2N、3N、12N、23N和123N等11个小种类型,其中能克服鉴别寄主上所有显性抗病基因的123N小种占22.2%,为优势小种;依据分子标记,81个菌株可分成A、a、Aa 3种交配型菌株及中性菌株,分别占49.4%、12.3%、29.6%和8.6%。此外,在同一区域内存在多个生理小种和不同的交配型菌株。

大斑病是一种世界性玉米叶部病害,可造成玉米产量严重降低,其致病菌大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)可在叶片形成坏死斑,影响玉米品质并造成严重经济损失。效应分子在植物病原真菌对植物侵染过程中发挥着重要作用。根据玉米大斑病菌Et28A菌株全基因组信息,利用Signal P、TMHMM、Protcomp、big-PI Predictor和TargetP生物信息学软件和预测程序对玉米大斑病菌中11698条蛋白序列进行候选效应分子预测,再通过对上述蛋白半胱氨酸含量、信号肽长度及冗余性分析,获

为了阐明玉米大斑病菌几丁质合成酶基因StCHS6在病菌生长发育及致病过程中的作用,克隆并解析了该基因及其编码蛋白的结构特征,明确了该基因在病菌生长发育过程中的表达模式。在玉米大斑病菌1号小种菌株01-23中克隆StCHS6,利用生物信息学手段分析该基因的结构特征,并利用已有的病菌重要发育阶段的RNA-Seq数据库信息,明确该基因的表达模式。结果发现,StCHS6位于病菌基因组scaffold_1:2066293-2069876(-)的位置,基因全长为3 584 bp,含有4个内含子和5个外显子;CDS序列大小为2 703 bp,编码900个氨基酸,脂肪指数为81.86,亲水性平均值为-0.178,等电点(PI)为8.36,不稳定指数为36.94,属于碱性稳定型蛋白;保守结构域分析表明,StCHS6蛋白含有几丁质合成酶催化结构域Chitin_synth_1和多个跨膜结构域;亚细胞定位分析推测该蛋白定位于细胞膜上;RNA-Seq数据分析表明,StCHS6在菌丝、分生孢子、芽管、附着胞和侵入钉5个发育时期均有表达,但其表达量有所差异。以芽管时期的表达量为1,菌丝、分生孢子、附着胞和侵入钉时期的表达量分别为芽管时期的3.80,4.97,3.40,2.60倍。为阐明玉米大斑病菌StCHS6的基因结构特征、表达模式及功能奠定了基础。

【目的】建立适合于大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)致病性相关突变体的快速筛选体系,为突变库中与致病性相关突变体的系统筛选和鉴定提供技术支撑。【方法】棉花幼苗接种于5.0×104、5.0×105、5.0×106、5.0×107和5.0×108孢子/m L的孢子悬浮液30 min,通过病情指数调查明确引起棉花黄萎病发生的病原菌浓度范围;对培养于培养瓶的大丽轮枝菌分别加入15、25、35和45 m L的灭菌水,利用血球计数板检测洗脱的孢子浓度,明确不同体积灭菌水对洗脱孢子悬浮液浓度的影响;以保存于96孔板的突变体为单位,在培养皿上进行单孢分离并挑取单个孢子于培养瓶中扩繁培养,培...

【目的】由大斑突脐蠕孢(Exserohilum turcicum)和玉蜀黍平脐蠕孢(Bipolaris maydis)引起的玉米大斑病和小斑病是玉米生产上重要的叶部真菌病害,本研究旨在建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法,为玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田间分布和有性生殖研究提供技术方法。【方法】根据GenBank中已登录的玉米大斑病菌(登录号MAT1-1:GU997138和MAT1-2:GU997137)和小斑病菌(登录号MAT1-1:X68399和MAT1-2:X68398)交配型基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计2种病原菌交配型多重PCR检测特异性引物,采用单因素法对引物的退火温度以及扩增程序中延伸时间和循环数等重要参数进行优化,建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法,并对2种病原菌的交配型多重PCR检测灵敏度和特异性进行检验。同时,对田间采集的129株玉米大斑病菌和194株玉米小斑病菌单孢菌株的交配型进行多重PCR检测,以明确建立的交配型多重PCR检测方法的适用性。【结果】建立的多重PCR方法和设计的交配型特异引物StMAT01-2F/R、StMAT02-3F/R、ChMAT01-3F/R和ChMAT02-2F/R可分别扩增出MAT1-1、MAT1-2型菌株大小为816、132 bp(大病斑菌)与490、136 bp(小病斑菌)的特异性目的条带。25μL多重PCR扩增体系:2×Multiplex PCR Mix 12.5μL,引物各10 pmol,DNA模板100 ng,退火温度为57.2℃(大病斑菌)和55.0℃(小斑病菌),35个循环。该多重PCR对玉米大斑病菌MAT1-1、MAT1-2型单孢菌株的检测灵敏度分别为0.1、0.01 ng基因组DNA,而对玉米小斑病菌MAT1-1、MAT1-2交配型的检测灵敏度均为0.1 ng基因组DNA。该交配型多重PCR检测方法对玉米大斑病菌和小斑病菌特异性很强,能够很好地区分玉米大斑病菌和小斑病菌相应的近缘种和14株其他真菌菌株。不同地理来源的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型检测结果表明,该多重PCR能够准确地检出129株玉米大斑病菌和194株玉米小斑病菌的交配型,且检测结果与随机抽取的菌株杂交验证结果完全吻合。【结论】构建的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法灵敏度高、特异性好、操作简便,能够准确、快速地检测出玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型,为玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田间分布和监测及有性生殖研究提供了可靠的技术方法。

为将雄性不育基因应用于甜玉米杂交制种中，达到降低劳动成本且保证种子纯度的目的。以来源于甜玉米自交系K78的雄性不育自发突变体male sterility 2020(ms2020)为材料，构建ms2020与甜玉米自交系M08的F_1及相应的F_2遗传群体，通过表型鉴定、遗传分析和基因定位研究ms2020甜玉米雄性不育突变体。表型鉴定结果表明：F_1群体均表现为雄性可育，F_2群体出现了育性分离。不育植株能够正常抽雄，但花药不开裂、散粉异常，花药变小且颜色淡黄；1%I_2-KI染色发现不育植株的花药内包含不能正常着色的败育花粉粒。遗传分析结果表明：育性正常植株与不育植株的比例符合3∶1,表明ms2020雄性不育突变体是由单基因控制的隐性突变体。利用BSA技术，初步将目的基因定位在7号染色体短臂上；随后利用初定位区间内的20对SSR标记对不育基因进行定位，将不育基因精细定位在标记S1和W10之间，物理距离为11.30 kb。该区间内包含Zm00001d018802和Zm00001d018803 2个注释基因；通过候选基因功能分析，推测已报道为玉米雄性不育基因的编码谷氧还蛋白的Zm00001d018802(ZmMs22/ZmMSCA1)基因可能是导致ms2020雄性不育的关键候选基因。本研究鉴定了ms2020甜玉米雄性不育突变体的败育特征和遗传特性，为甜玉米雄性不育化杂交制种提供了材料；同时，本研究定位到突变体的关键候选基因，为进一步解析其雄性不育的分子机制奠定了基础。

利用航空诱变处理糯玉米自交系S147,获得矮秆突变体,并对其株高、叶片生长情况进行分析。结果表明:所获得的矮秆突变在整个生育期的不同发育阶段与对照的株高差异均达极显著水平,并且随着发育进程的推进,株高的差异逐渐加大;航空诱变还影响突变体叶片的发育进程,但成株期总叶片数保持不变。