【目的】Cks1(cyclin-dependent kinase subunit 1)是细胞周期蛋白依赖性激酶复合体CDK(cyclin-dependent kinase)的结构亚基，是细胞周期调控过程中的关键基因。论文旨在鉴定玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）StCks1，分析玉米大斑病菌附着胞发育过程中StCks1表达量差异及其互作蛋白，为进一步研究StCks1在附着胞发育中的作用打下基础。【方法】通过对玉米大斑病菌野生型菌株01-23全基因组数据分析，获取StCks1蛋白序列；利用软件MEGA 5.0和在线数据库Pfam、SMART对酿酒酵母、裂殖酵母和拟南芥等物种Cks1蛋白进行系统发育树构建和保守结构域分析；收集玉米大斑病菌附着胞发育不同时期样品进行转录组测序以及表达量分析。利用原核诱导表达系统，构建原核表达载体pGEX-6p-3-StCks1，并转化大肠杆菌表达菌株BL21，对重组蛋白GST-StCks1诱导表达纯化；通过GST pull-down、Western blot技术和酵母双杂交试验，鉴定StCks1的互作蛋白。【结果】玉米大斑病菌全基因组中鉴定到唯一StCks1蛋白编码基因，该蛋白由130个氨基酸组成；其三级结构主要由4股β折叠和3个α螺旋构成，含有HxPEPH(His-anyPro-Glu-Pro-His)保守位点和Cks保守结构域；通过转录组测序和表达量分析发现，StCks1在附着胞发育不同时期表达量显著上调；重组蛋白GST-StCks1在1 mmol·L-1 IPTG,30℃诱导2 h可获得大量可溶性蛋白；通过GST pull-down技术获取大量互作蛋白并进行质谱鉴定，通过Western blot和酵母双杂交试验，验证StCks1与细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1存在互作。【结论】玉米大斑病菌中含有唯一的StCks1，通过与细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1互作调控附着胞的发育。

【目的】克隆蛋白激酶C基因(PKC)及其启动子,验证该基因拷贝数,同时对PKC的表达规律进行研究,了解该基因在信号转导途径中的激活条件,为进一步研究该基因的功能奠定基础。【方法】首先通过简并引物PCR法获得PKC的同源片段,再利用Genome walking技术克隆片段的3′端和5′端侧翼序列,采用RT-PCR法扩增基因全长,并对基因结构和上游调控元件进行生物信息学分析。利用Southern blotting验证基因拷贝数。最后,利用半定量RT-PCR技术研究玉米大斑病菌在不同碳源、氮源培养以及非生物胁迫条件下,PKC的表达量的变化规律。【结果】获得PKC全长序列及其上游部分启动子区,生物信息...

为了更好理解大叶落地生根中细胞周期调控的分子机制,利用RACE-PCR技术从大叶落地生根中克隆了1个新的基因KdCDK。该基因编码295个氨基酸残基,分子量为34.12kDa,等电点为6.15,其开放阅读框长度为888bp。其蛋白与笋瓜CDK蛋白的同源性最高,属于CDKA类蛋白家族。实时荧光定量PCR分析表明,该蛋白基因在大叶落地生根的根中表达量最高,且受渗透胁迫(甘露醇)的诱导上调表达。从大叶落地生根中克隆出KdCDK基因,为将来该基因的功能研究打下了基础。

【目的】利用RNA干扰技术探讨玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因StPKS的功能。【方法】将玉米大斑病菌StPKS基因片段连接到pSilent-1载体中,构建StPKS的RNA干扰载体pSilent-StPKS1-2。利用聚乙二醇(PEG)介导的方法将之转入玉米大斑病菌野生型菌株01-23的原生质体中,通过潮霉素筛选得到转化子,采用半定量RT-PCR方法分析转化子中StPKS的表达情况,显微观察转化子与野生型菌丝形态的差异。【结果】本研究构建了StPKS RNA干扰载体并进行了成功转化,经潮霉素抗性筛选和PCR验证最终获得了9个阳性转化子,其中5个转化子菌落颜色变浅。对转化子进行半定量PCR分析发现...

【目的】小柱孢酮脱水酶（scytalone dehydratase,SCD）是黑色素合成过程中的关键酶。本文旨在鉴定玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）小柱孢酮脱水酶基因（StSCD）家族，并分析玉米大斑病菌附着胞发育过程中StSCD基因家族表达量差异及SCD抑制剂对黑色素合成的影响，为进一步研究StSCD基因家族在黑色素合成和附着胞发育中的作用打下基础。【方法】利用玉米大斑病菌野生型菌株01-23的全基因组数据，获得StSCD基因家族的全序列，并与玉米小斑病菌（Cochlibolus heterostrophus）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、瓜类炭疽病菌（Colletotrichum lagenaria）等真菌的SCD进行序列比对；收集玉米大斑病菌附着胞不同发育时期的材料进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析，获得不同时期、不同StSCD的表达量，从而确定与病菌侵染和附着胞黑色素化密切相关的脱水酶基因；使用SCD抑制剂环丙酰菌胺处理玉米大斑病菌，测定菌落生长速度、黑色素合成量、附着胞膨压等，确定StSCD在附着胞发育过程中的作用。【结果】玉米大斑病菌全基因组中共鉴定到4个StSCD，其编码蛋白具有SCD保守结构域及保守的催化及底物结合氨基酸残基。StSCD3与灰葡萄孢（Botrytis cinerea）中功能冗余的SCD2蛋白具有较高同源性，StSCD4与多主棒孢（Corynespora cassiicola）中参与黑色素合成的SCD蛋白具有较高同源性。通过分析玉米大斑病菌生长发育过程中不同时期StSCD的表达量发现，在附着胞时期4个StSCD表达量均上调，其中StSCD3、StSCD4表达量上调尤为显著，附着胞再生菌丝时期StSCD3、StSCD4的表达量均显著下降，并且在附着胞诱导整个时期StSCD4的表达量较高。环丙酰菌胺处理玉米大斑病菌后，黑色素合成受阻，附着胞膨压显著降低。【结论】玉米大斑病菌含有4个StSCD，推测StSCD4参与DHN(1,8-间苯二酚)黑色素的合成，并进而影响附着胞膨压积累。

【目的】克隆玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）小分子热激蛋白（small heat shock protein,sHSP）基因，分析其结构及在病菌发育和HT-毒素诱导过程中的表达模式。【方法】利用隐马尔可夫模型（hidden Markov model,HMM）筛选玉米大斑病菌全基因组范围内的sHSP家族成员，采用PCR技术克隆玉米大斑病菌01-23菌株的sHSP，通过生物信息学方法进行sHSP的理化性质分析、亚细胞定位、结构预测和系统发育分析，RNA-Seq和RT-qPCR分析sHSP在玉米大斑病菌不同发育阶段和HT-毒素诱导过程中的表达情况。【结果】从玉米大斑病菌基因组筛选到3个sHSP家族成员（StHSP37.2、StHSP37.0和StHSP22.6），克隆了01-23菌株中3个sHSP的DNA序列，编码的sHSP蛋白均属于弱酸、亲水蛋白，无跨膜结构域和信号肽；二级结构中无规则卷曲占58.97%—60.35%，而β-转角仅为2.69%—7.83%；亚细胞定位预测StHSP37.2和StHSP37.0位于细胞核，而StHSP22.6位于细胞核和细胞质；均含有近C端的ACD＿sHSP-like结构域，StHSP37.2、StHSP37.0和StHSP22.6分别有2、3和5个保守基序；利用SWISS-Model和AlphaFill构建了sHSP单体的三级结构模型；系统发育分析结果表明，StHSP22.6与链格孢（Alternaria alternata）、StHSP37.2和StHSP37.0与玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）的sHSP亲缘关系较近；玉米大斑病菌sHSP在菌丝中表达量最高，其次为芽管、附着胞和侵入钉，在分生孢子中表达量最低；StHSP22.6和StHSP37.2与玉米大斑病菌HT-毒素诱导显著负相关，在14 d时相对基因表达量分别上调6.45和18.12倍，21、28 d时StHSP37.2表达量仅上调2.56、1.78倍，而StHSP22.6表达量与WT无显著差异；StHSP37.0与HT-毒素诱导显著正相关，14、21和28 d时相对基因表达量分别下调59.23%、86.30%和88.11%；通过与玉米大斑病菌sHSP显著相关的表达基因挖掘，推测StHSP37.2和StHSP22.6主要与HSP90、HSP104、分解代谢及线粒体Mg2+转运有关，而StHSP37.0主要与液泡碱性氨基酸转运、有机合成和分泌有关。【结论】玉米大斑病菌sHSP家族成员既具有高度保守性，又与其他sHSP有结构和系统发育的差异性；不仅与玉米大斑病菌菌丝、芽管、附着胞和侵入钉发育相关，在HT-毒素诱导过程中也发挥重要调控作用。

为了明确StSNF1在玉米大斑病菌基因组中的位置,解析该基因编码蛋白的结构特征,探究该基因在侵染寄主的不同时期、分生孢子萌发侵染过程中以及不同碳源培养下的表达情况。结果表明,该基因ID号为008026214,全长3 046 bp,位于scaffold_17负链的97 793-100 838位置。StSNF1与玉米圆斑病菌SNF1同源关系较近,由877个氨基酸残基编码而成。StSNF1蛋白具有氮端的蛋白激酶结构域、氮端的碳代谢产物去阻遏蛋白激酶结构域和碳端的激酶相关结构域。在蛋白激酶结构域内,具有ATP结合

【目的】获得玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)cAMP信号转导途径中腺苷酸环化酶基因(StAC),利用基因敲除技术明确其在病菌致病过程中的功能。【方法】应用简并引物PCR和Genome Walking技术克隆玉米大斑病菌腺苷酸环化酶基因(StAC)DNA全长序列,并对该基因进行生物信息学分析;利用Southern blotting验证基因拷贝数;通过基因敲除技术创制StAC的缺失突变体,研究玉米大斑病菌cAMP信号转导途径中StAC的功能。【结果】StAC的DNA全长为6 816 bp,由5个外显子和4个内含子组成;ORF为6 018 bp,编码2 005个氨基酸,同源序...

【目的】克隆强抗寒性牧草短芒大麦钙依赖蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase,CDPK)基因,分析其生理生化特性,为理想抗逆工程基因的筛选和利用奠定基础。【方法】采用RACE-PCR技术,获得短芒大麦CDPK基因全长cDNA序列;采用Northern杂交分析该基因在逆境条件下(低温(4℃)、干旱(200 g/L PEG6000)、盐(300 mmol/L NaCl)、激素(100μmol/L ABA))的表达模式;采用农杆菌介导的方法,对该基因编码蛋白进行亚细胞定位,并对转基因烟草的离子渗漏率和脯氨酸含量进行测定。【结果】获得了短芒大麦CDPK基因的编码序列...

【目的】确定玉米大斑病菌STK2在基因组中的位置;解析目的蛋白质Stk2的结构特征;构建STK2真核表达载体,获得真核表达体系中的胞外分泌蛋白。【方法】利用生物信息学方法,确定STK2在玉米大斑病菌基因组中的确切位置,解析Stk2蛋白质的结构特征;根据STK2的ORF序列及真核表达载体pPIC9K的多克隆位点设计引物,构建真核表达载体,采用电击转化法将重组质粒转入宿主菌GS115中进行诱导表达,利用SDS-PAGE检测并鉴定目的蛋白质。【结果】玉米大斑病菌STK2的ID为91433,该基因位于scaffold_3正链的1561986-1563262位置;Stk2蛋白具有MAPK类蛋白激酶的特征...

为了解细胞周期蛋白E(cyclin E)基因在斑节对虾(Penaeus monodon)发育过程中的作用,构建和测序了斑节对虾全组织cDNA文库,获得了斑节对虾细胞周期蛋白(Pmcyclin)E的部分表达序列。通过RACE技术克隆得到1条全长1 706 bp的cDNA序列。Pmcyclin E开放阅读框(ORF)为1 263 bp,编码420个氨基酸。生物信息学分析表明,该氨基酸序列含有周期蛋白家族特有的CYCLIN保守区并含有N-糖基化位点及磷酸化位点。经BLAST同源性分析表明,该基因编码蛋白与红火蚁(Solenopsis invicta)、切叶蜂(Megachile rotundata)...

应用BLAST比对技术,在松材线虫基因组数据中鉴定得到模式线虫pdk–1的同源基因Bxpdk–1。结合RT–PCR技术进行Bxpdk–1基因完整蛋白编码区(CDS)扩增,得到CDS区全长2298bp。Bx PDK–1蛋白含有"STKc_PDK1""PH_PDK1"2个保守结构域,属于磷酸肌醇激酶超家族。序列比对及进化树分析显示,松材线虫Bx PDK–1蛋白与捻转血矛线虫PDK–1蛋白(CDJ88126.1)同源性为50%,进化树聚在同一小分支上,亲缘关系较近。原位杂交试验表明,Bxpdk–1基因主要在线虫的头部神经元及咽部神经处表达。q PCR结果分析显示,Bxpdk–1基因表达响应鱼藤酮药剂胁迫处理。RNAi试验显示,Bxpdk–1在dsRNA处理12 h时,基因表达量显著下降,基因被沉默。

以玉米(Zea mags L.)为材料,利用RT-PCR和RACE技术,从ABA处理的玉米叶片中克隆了1个新的A族促分裂原激活蛋白激酶(MAPK)基因,命名为ZmMPK7(GenBank登录号:EU616650)。生物信息学分析表明:该基因全长1 709 bp,编码397个氨基酸,推测相对分子质量为44.9×103,pI 5.31。ZmMPK7包含有MAP激酶11个相对保守结构域和1个TEY的磷酸化基序。对玉米不同组织中ZmMPK7基因的转录水平分析表明:ZmMPK7基因的转录没有组织专一性。非生物胁迫处理下ZmMPK7基因表达研究发现:ABA、H2O2、干旱、盐胁迫、低温及重金属处理均诱导Z...

【目的】对玉米大斑病菌（ＳｅｔｏＳｐｈａｅｒｉａ ｔｕｒｃｉｃａ）漆酶基因Ｓｔｌａｃ２进行生物信息学分析，推测其蛋白功能，探究木质素降解过程中产生的小分子物质对Ｓｔｌａｃ２表达的影响，并对其进行克隆及原核表达，以便深入研究该基因在病菌生长、发育及致病过程中的作用。【方法】通过ＮｃＢｉ查询获得玉米大斑病菌ｅｏａ９００７０（Ｓｔｌａｃ２）基因的全序列，通过ｃｌｕＳｔａｌ Ｘ与马尔尼菲青霉菌（ｐｅＮｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒＮｅｆｆｅｉ）ｐＢｒＢ（ｐｍａａ＿０８２０６０）基因、烟曲霉（ａＳｐｅｒｇｉｌｌｕＳ ｆｕｍｉｇａｔｕＳ）ａＢｒ２（ａｆｕａ＿２ｇ１７５３０）基因、构巢曲菌（ａＳｐｅｒｇｉｌｌｕＳ．．．

【目的】从全基因组水平上鉴定玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)Homeobox转录因子家族及其分布,阐明该家族的序列及进化特征,分析该家族基因在病菌不同生长发育时期的表达规律。【方法】利用生物信息学手段搜索玉米大斑病菌全基因组数据库,鉴定Homeobox转录因子家族;采用MEGA 5.0软件进行系统进化树分析;利用在线工具GSDS(gene structure display server)(http://gsds1.cbi.pku.edu.cn/index.php)绘制基因结构图;