为明确玉米大斑病菌中是否存在漆酶以及影响酶活性的因素,以ABTS为底物采用分光光度计测定了420nm下不同Cu2+浓度和不同缓冲液pH值条件下的玉米大斑病菌胞内漆酶活性。根据子囊菌已知漆酶Cu2+结合位点的保守区域设计简并引物,以玉米大斑病菌cDNA为模板扩增漆酶基因的特异片段。结果表明,玉米大斑病菌中存在漆酶,且漆酶活性与Cu2+浓度和缓冲液pH值相关,pH值为2.6,Cu2+浓度为250μmol/L时漆酶活性最高;通过PCR技术克隆获得了一个929 bp的基因片段,生物信息学分析发现,该基因序列含有漆酶基因保守的Cu-oxidise superfam-ily,与其他子囊菌中漆酶的氨基酸序列...

【目的】克隆蛋白激酶C基因(PKC)及其启动子,验证该基因拷贝数,同时对PKC的表达规律进行研究,了解该基因在信号转导途径中的激活条件,为进一步研究该基因的功能奠定基础。【方法】首先通过简并引物PCR法获得PKC的同源片段,再利用Genome walking技术克隆片段的3′端和5′端侧翼序列,采用RT-PCR法扩增基因全长,并对基因结构和上游调控元件进行生物信息学分析。利用Southern blotting验证基因拷贝数。最后,利用半定量RT-PCR技术研究玉米大斑病菌在不同碳源、氮源培养以及非生物胁迫条件下,PKC的表达量的变化规律。【结果】获得PKC全长序列及其上游部分启动子区,生物信息...

【目的】获得玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)cAMP信号转导途径中腺苷酸环化酶基因(StAC),利用基因敲除技术明确其在病菌致病过程中的功能。【方法】应用简并引物PCR和Genome Walking技术克隆玉米大斑病菌腺苷酸环化酶基因(StAC)DNA全长序列,并对该基因进行生物信息学分析;利用Southern blotting验证基因拷贝数;通过基因敲除技术创制StAC的缺失突变体,研究玉米大斑病菌cAMP信号转导途径中StAC的功能。【结果】StAC的DNA全长为6 816 bp,由5个外显子和4个内含子组成;ORF为6 018 bp,编码2 005个氨基酸,同源序...

【目的】克隆玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）小分子热激蛋白（small heat shock protein,sHSP）基因，分析其结构及在病菌发育和HT-毒素诱导过程中的表达模式。【方法】利用隐马尔可夫模型（hidden Markov model,HMM）筛选玉米大斑病菌全基因组范围内的sHSP家族成员，采用PCR技术克隆玉米大斑病菌01-23菌株的sHSP，通过生物信息学方法进行sHSP的理化性质分析、亚细胞定位、结构预测和系统发育分析，RNA-Seq和RT-qPCR分析sHSP在玉米大斑病菌不同发育阶段和HT-毒素诱导过程中的表达情况。【结果】从玉米大斑病菌基因组筛选到3个sHSP家族成员（StHSP37.2、StHSP37.0和StHSP22.6），克隆了01-23菌株中3个sHSP的DNA序列，编码的sHSP蛋白均属于弱酸、亲水蛋白，无跨膜结构域和信号肽；二级结构中无规则卷曲占58.97%—60.35%，而β-转角仅为2.69%—7.83%；亚细胞定位预测StHSP37.2和StHSP37.0位于细胞核，而StHSP22.6位于细胞核和细胞质；均含有近C端的ACD＿sHSP-like结构域，StHSP37.2、StHSP37.0和StHSP22.6分别有2、3和5个保守基序；利用SWISS-Model和AlphaFill构建了sHSP单体的三级结构模型；系统发育分析结果表明，StHSP22.6与链格孢（Alternaria alternata）、StHSP37.2和StHSP37.0与玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）的sHSP亲缘关系较近；玉米大斑病菌sHSP在菌丝中表达量最高，其次为芽管、附着胞和侵入钉，在分生孢子中表达量最低；StHSP22.6和StHSP37.2与玉米大斑病菌HT-毒素诱导显著负相关，在14 d时相对基因表达量分别上调6.45和18.12倍，21、28 d时StHSP37.2表达量仅上调2.56、1.78倍，而StHSP22.6表达量与WT无显著差异；StHSP37.0与HT-毒素诱导显著正相关，14、21和28 d时相对基因表达量分别下调59.23%、86.30%和88.11%；通过与玉米大斑病菌sHSP显著相关的表达基因挖掘，推测StHSP37.2和StHSP22.6主要与HSP90、HSP104、分解代谢及线粒体Mg2+转运有关，而StHSP37.0主要与液泡碱性氨基酸转运、有机合成和分泌有关。【结论】玉米大斑病菌sHSP家族成员既具有高度保守性，又与其他sHSP有结构和系统发育的差异性；不仅与玉米大斑病菌菌丝、芽管、附着胞和侵入钉发育相关，在HT-毒素诱导过程中也发挥重要调控作用。

【目的】克隆玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)Gα亚基(Heterotrimeric Gproteinalpha subunit)基因及其启动子,并对其进行异源表达,为深入研究Gα基因的表达规律、基因功能和编码蛋白的特性奠定基础。【方法】首先通过简并引物PCR法获得Gα基因的同源片段,再利用Genome walking技术克隆片段的5′端和3′端侧翼序列,最后采用RT-PCR法扩增基因全长,并对基因结构和上游调控元件进行生物信息学分析。同时,利用pET原核表达系统获得基因的编码产物。【结果】获得1个玉米大斑病菌Gα基因—Stga-2的全长序列及其上游部分启动子区,并利用p...

以真菌毒素与分子植物病理学实验室前期分离、鉴定并保存的玉米大斑病菌菌株F1-40(A交配型菌株)、01-23(a交配型菌株)为试验材料,利用候选基因法,通过PCR扩增和Genome Walking技术,对A交配型菌株和a交配型菌株的MAT基因进行同源片段扩增,从而获得基因全长及其侧翼序列,进一步利用生物信息学方法对扩增得到的MAT基因全长进行保守结构域分析,利用玉米大斑病菌基因组数据库的Blast序列比对软件将MAT1基因和MAT2基因的侧翼序列进行比对。研究结果表明,在不同交配型的玉米大斑病菌中,A交配型的菌株中含有A交配型基因MAT1,a交配型菌株中含有a交配型基因MAT2。2个基因均含有...

【目的】获得玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)环腺苷酸磷酸二酯酶(c AMP phosphodiesterase,PDE)基因,并分析其在病菌侵染结构发育过程及侵染寄主早期阶段中的表达,为深入探索c AMP信号途径调控病菌致病性的作用机制打下基础。【方法】根据酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、绿僵菌(Metarhi

【目的】对玉米大斑病菌（ＳｅｔｏＳｐｈａｅｒｉａ ｔｕｒｃｉｃａ）漆酶基因Ｓｔｌａｃ２进行生物信息学分析，推测其蛋白功能，探究木质素降解过程中产生的小分子物质对Ｓｔｌａｃ２表达的影响，并对其进行克隆及原核表达，以便深入研究该基因在病菌生长、发育及致病过程中的作用。【方法】通过ＮｃＢｉ查询获得玉米大斑病菌ｅｏａ９００７０（Ｓｔｌａｃ２）基因的全序列，通过ｃｌｕＳｔａｌ Ｘ与马尔尼菲青霉菌（ｐｅＮｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒＮｅｆｆｅｉ）ｐＢｒＢ（ｐｍａａ＿０８２０６０）基因、烟曲霉（ａＳｐｅｒｇｉｌｌｕＳ ｆｕｍｉｇａｔｕＳ）ａＢｒ２（ａｆｕａ＿２ｇ１７５３０）基因、构巢曲菌（ａＳｐｅｒｇｉｌｌｕＳ．．．

碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子蛋白是一类在动植物及微生物中结构和功能均具有保守性的转录调控因子，为明确bZIP类转录因子在植物病原真菌中的功能及作用机制，进一步确定其与病菌生长发育及致病性的关系，以玉米大斑病菌01-23为材料克隆得到了StbZIP9基因(GenBank No.XM＿008032179.1),StbZIP9是bZIP转录因子家族成员之一，对该基因结构及蛋白质特征分析结果显示，该基因全长788 bp,开放阅读框为726 bp,编码241个氨基酸，其编码蛋白包含一个在真菌中高度保守的同源结构域BRLZ;对该基因在病菌生长发育及侵染宿主过程的RNA-seq数据进行分析，发现与菌丝时期相比StbZIP9在附着胞和芽管时期表达量升高2～4倍，在侵染玉米叶片24,72 h后基因表达从无到有且持续升高，表明StbZIP9与附着胞发育和芽管形成相关联并在病菌侵染宿主细胞过程中发挥重要作用；进一步利用生物信息学技术预测其结合保守基序及调控的靶基因，结合基序为NNTWACGTNN,包含bZIP类转录因子识别核心序列ACGT,并根据该序列预测StbZIP9下游靶基因，结合RNA-seq数据进行表达模式分析得到4个下游靶基因(JGI数据库中蛋白ID分别为：132893、163024、162798、40466),功能注释表明，其参与细胞壁组分聚合和运输、侵染宿主、孢子休眠等多种生物过程。为进一步阐明其在参与调控病菌侵染寄主的分子机制提供依据。

【目的】利用RNA干扰技术探讨玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因StPKS的功能。【方法】将玉米大斑病菌StPKS基因片段连接到pSilent-1载体中,构建StPKS的RNA干扰载体pSilent-StPKS1-2。利用聚乙二醇(PEG)介导的方法将之转入玉米大斑病菌野生型菌株01-23的原生质体中,通过潮霉素筛选得到转化子,采用半定量RT-PCR方法分析转化子中StPKS的表达情况,显微观察转化子与野生型菌丝形态的差异。【结果】本研究构建了StPKS RNA干扰载体并进行了成功转化,经潮霉素抗性筛选和PCR验证最终获得了9个阳性转化子,其中5个转化子菌落颜色变浅。对转化子进行半定量PCR分析发现...

大斑病是一种世界性玉米叶部病害,可造成玉米产量严重降低,其致病菌大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)可在叶片形成坏死斑,影响玉米品质并造成严重经济损失。效应分子在植物病原真菌对植物侵染过程中发挥着重要作用。根据玉米大斑病菌Et28A菌株全基因组信息,利用Signal P、TMHMM、Protcomp、big-PI Predictor和TargetP生物信息学软件和预测程序对玉米大斑病菌中11698条蛋白序列进行候选效应分子预测,再通过对上述蛋白半胱氨酸含量、信号肽长度及冗余性分析,获

为了阐明玉米大斑病菌几丁质合成酶基因StCHS6在病菌生长发育及致病过程中的作用,克隆并解析了该基因及其编码蛋白的结构特征,明确了该基因在病菌生长发育过程中的表达模式。在玉米大斑病菌1号小种菌株01-23中克隆StCHS6,利用生物信息学手段分析该基因的结构特征,并利用已有的病菌重要发育阶段的RNA-Seq数据库信息,明确该基因的表达模式。结果发现,StCHS6位于病菌基因组scaffold_1:2066293-2069876(-)的位置,基因全长为3 584 bp,含有4个内含子和5个外显子;CDS序列大小为2 703 bp,编码900个氨基酸,脂肪指数为81.86,亲水性平均值为-0.178,等电点(PI)为8.36,不稳定指数为36.94,属于碱性稳定型蛋白;保守结构域分析表明,StCHS6蛋白含有几丁质合成酶催化结构域Chitin_synth_1和多个跨膜结构域;亚细胞定位分析推测该蛋白定位于细胞膜上;RNA-Seq数据分析表明,StCHS6在菌丝、分生孢子、芽管、附着胞和侵入钉5个发育时期均有表达,但其表达量有所差异。以芽管时期的表达量为1,菌丝、分生孢子、附着胞和侵入钉时期的表达量分别为芽管时期的3.80,4.97,3.40,2.60倍。为阐明玉米大斑病菌StCHS6的基因结构特征、表达模式及功能奠定了基础。

以前期研究中筛选得到的强毒菌株和弱毒菌株为试材,旨在探讨不同毒性玉米大斑病菌侵染对寄主多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)活性的影响。在确定了检测玉米PPO活性的最佳反应体系及最佳酶活测定时间的基础上,建立了快速准确测定PPO活性的方法;探讨了玉米大斑病菌强毒菌株YC和弱毒菌株01-23T侵染对寄主PPO活性的影响,结果发现,在优化的最佳试验条件下,弱毒菌株01-23T侵染对寄主防御酶PPO的影响与强毒菌株YC有很大不同,前者比后者更容易引发寄主防御反应,使寄主防御酶活性升高、抵抗力得以维持。为深入探讨玉米大斑病菌与玉米之间的相互作用奠定了基础。

为明确东北地区玉米大斑病菌的生理分化及小种动态情况,分析玉米大斑病加重的原因。采用常规Ht单基因(Ht1、Ht2、Ht3、HtN)鉴别寄主鉴定技术,对2010年采自辽宁、吉林、黑龙江省22个县(市)88份玉米大斑病菌的菌株进行了生理小种鉴定,共鉴定出0、1、2、N、12、1N、23、2N、3N、12N、123N、123、23N和12N号14个生理小种;东北地区大斑病菌生理分化明显,出现了能够克服多个抗性基因的小种,其中,0号和1号生理小种分别占供试菌株的37.5%和20.5%,为优势小种;所鉴定的88个菌株对Ht1、Ht2、Ht3和HtN抗性基因的毒性频率分别为45.5%,30.7%,15.9...

为明确近年来中国玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)的生理小种变化和种群消长情况,分析玉米大斑病逐年加重的原因。采用常规Ht单基因(Ht1、Ht2、Ht3和HtN)鉴别寄主,对2005年和2006年采自黑龙江、吉林、辽宁、河北、山东、陕西、山西、河南、四川和北京-天津-唐山地区共10个省区28个地区的204个玉米大斑病菌菌株进行了生理小种鉴定;利用毒力频率法分析玉米大斑病菌的生理分化及其在中国的分布频率。结合前人研究结果,分析了近30年中国玉米大斑病菌生理小种变化趋势。共鉴定出0,1,2,3,12,13,23,123,23N共9个生理小种,其中0号小种和1号小种为优势小种,...