【目的】由大斑突脐蠕孢(Exserohilum turcicum)和玉蜀黍平脐蠕孢(Bipolaris maydis)引起的玉米大斑病和小斑病是玉米生产上重要的叶部真菌病害,本研究旨在建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法,为玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田间分布和有性生殖研究提供技术方法。【方法】根据GenBank中已登录的玉米大斑病菌(登录号MAT1-1:GU997138和MAT1-2:GU997137)和小斑病菌(登录号MAT1-1:X68399和MAT1-2:X68398)交配型基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计2种病原菌交配型多重PCR检测特异性引物,采用单因素法对引物的退火温度以及扩增程序中延伸时间和循环数等重要参数进行优化,建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法,并对2种病原菌的交配型多重PCR检测灵敏度和特异性进行检验。同时,对田间采集的129株玉米大斑病菌和194株玉米小斑病菌单孢菌株的交配型进行多重PCR检测,以明确建立的交配型多重PCR检测方法的适用性。【结果】建立的多重PCR方法和设计的交配型特异引物StMAT01-2F/R、StMAT02-3F/R、ChMAT01-3F/R和ChMAT02-2F/R可分别扩增出MAT1-1、MAT1-2型菌株大小为816、132 bp(大病斑菌)与490、136 bp(小病斑菌)的特异性目的条带。25μL多重PCR扩增体系:2×Multiplex PCR Mix 12.5μL,引物各10 pmol,DNA模板100 ng,退火温度为57.2℃(大病斑菌)和55.0℃(小斑病菌),35个循环。该多重PCR对玉米大斑病菌MAT1-1、MAT1-2型单孢菌株的检测灵敏度分别为0.1、0.01 ng基因组DNA,而对玉米小斑病菌MAT1-1、MAT1-2交配型的检测灵敏度均为0.1 ng基因组DNA。该交配型多重PCR检测方法对玉米大斑病菌和小斑病菌特异性很强,能够很好地区分玉米大斑病菌和小斑病菌相应的近缘种和14株其他真菌菌株。不同地理来源的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型检测结果表明,该多重PCR能够准确地检出129株玉米大斑病菌和194株玉米小斑病菌的交配型,且检测结果与随机抽取的菌株杂交验证结果完全吻合。【结论】构建的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法灵敏度高、特异性好、操作简便,能够准确、快速地检测出玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型,为玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田间分布和监测及有性生殖研究提供了可靠的技术方法。

采用2套Ht单基因鉴别品种,对2007-2009年采自云南省13个地区的81份玉米大斑病菌菌株进行了生理小种鉴定,利用分子标记技术对菌株交配型进行了分析。结果表明,云南省玉米大斑病菌生理小种和交配型组成复杂,81个菌株可分为0、1、2、3、12、23、2N、3N、12N、23N和123N等11个小种类型,其中能克服鉴别寄主上所有显性抗病基因的123N小种占22.2%,为优势小种;依据分子标记,81个菌株可分成A、a、Aa 3种交配型菌株及中性菌株,分别占49.4%、12.3%、29.6%和8.6%。此外,在同一区域内存在多个生理小种和不同的交配型菌株。

明确东北地区玉米大斑病菌交配型组成情况及遗传结构,为进一步深入研究玉米大斑病的发生、流行及防控技术提供理论依据。利用交配型鉴定特异引物对2017年采自辽宁、吉林、黑龙江、内蒙古4个省(自治区)34个市县的57株玉米大斑病菌进行交配型测定,并采用相关序列扩增多态性(SRAP)分子标记技术对供试菌株进行遗传多样性分析。测定结果表明:东北地区玉米大斑病菌主要包括2种交配型,即仅含StMAT1-2基因的a交配型和仅含StMAT1-1基因的A交配型,且a交配型的比例(78.95%)明显高于A交配型(21.05%),表现出明显的不平衡现象。遗传多样性分析结果表明:从100对SRAP通用引物中筛选出多态性较好且稳定的8对引物组合,共扩增出64条条带,不同引物组合对供试菌株扩增条带数量不同,引物组合Me5/Em9和Me8/Em1扩增的条带数量最多,Me3/Em3扩增的条带数量最少,其中多态性条带44条,平均每个引物组合扩增出5.5个多态性条带,多态性位点比率为68.75%。UPGMA聚类分析显示,供试菌株遗传相似系数介于0.76～1.00,在阈值为0.82时,所有菌株被分为4个类群,表现出丰富的遗传多样性。SRAP划分结果表明:类群Ⅰ中菌株均为A交配型,a交配型菌株均聚集于类群Ⅱ中,说明玉米大斑病菌遗传类群和交配型之间存在密切关系,但二者均与菌株地理来源无明显相关性。

【目的】了解玉米大斑病菌有性杂交后代交配型和致病性分化情况,明确有性杂交与菌株变异间的关系。【方法】以01-12和01-15为出发菌株,人工诱导玉米大斑病菌的有性后代,获得F1代菌株,再以F1代菌株40和42为亲本,获得有性杂交F2代菌株;对有性后代进行交配型和寄生适合度测定;采用毛细管电泳技术分析不同致病类型菌株的毒素含量。【结果】在室内条件下连续诱导产生玉米大斑病菌的2个有性世代,获得了79个F1代菌株和32个F2代菌株;后代菌株的交配型发生了明显分化,出现了A、a、Aa和中性菌株,其中F1代A、a分离比例明显偏离1﹕1;寄生适合度测定结果表明,F1代和F2代菌株较亲本均发生了寄生适合度分...

以真菌毒素与分子植物病理学实验室前期分离、鉴定并保存的玉米大斑病菌菌株F1-40(A交配型菌株)、01-23(a交配型菌株)为试验材料,利用候选基因法,通过PCR扩增和Genome Walking技术,对A交配型菌株和a交配型菌株的MAT基因进行同源片段扩增,从而获得基因全长及其侧翼序列,进一步利用生物信息学方法对扩增得到的MAT基因全长进行保守结构域分析,利用玉米大斑病菌基因组数据库的Blast序列比对软件将MAT1基因和MAT2基因的侧翼序列进行比对。研究结果表明,在不同交配型的玉米大斑病菌中,A交配型的菌株中含有A交配型基因MAT1,a交配型菌株中含有a交配型基因MAT2。2个基因均含有...

【目的】建立高效的玉米大斑病菌REMI遗传转化体系,进而利用该技术创制突变体,为克隆病菌生长发育和致病性相关的基因奠定基础。【方法】摸索玉米大斑病菌原生质体制备的菌龄、酶系统及酶解条件、原生质体收集方式、转化子最适潮霉素B筛选浓度以及转化使用的质粒,建立该病菌高效的REMI转化体系;利用PCR技术对潮霉素B抗性转化子进行筛选并对部分突变体进行分析。【结果】培养20 h的幼嫩菌丝,用浓度分别达到1.25%的Lyallzyme、Snailase和Drislase 3种酶混和液酶解4 h、离心速度为3 000 r/min时原生质体产量最大;当潮霉素B浓度为50μg·mL-1时,野生型菌株的分生孢子萌...

为明确东北地区玉米大斑病菌的生理分化及小种动态情况,分析玉米大斑病加重的原因。采用常规Ht单基因(Ht1、Ht2、Ht3、HtN)鉴别寄主鉴定技术,对2010年采自辽宁、吉林、黑龙江省22个县(市)88份玉米大斑病菌的菌株进行了生理小种鉴定,共鉴定出0、1、2、N、12、1N、23、2N、3N、12N、123N、123、23N和12N号14个生理小种;东北地区大斑病菌生理分化明显,出现了能够克服多个抗性基因的小种,其中,0号和1号生理小种分别占供试菌株的37.5%和20.5%,为优势小种;所鉴定的88个菌株对Ht1、Ht2、Ht3和HtN抗性基因的毒性频率分别为45.5%,30.7%,15.9...

为明确近年来中国玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)的生理小种变化和种群消长情况,分析玉米大斑病逐年加重的原因。采用常规Ht单基因(Ht1、Ht2、Ht3和HtN)鉴别寄主,对2005年和2006年采自黑龙江、吉林、辽宁、河北、山东、陕西、山西、河南、四川和北京-天津-唐山地区共10个省区28个地区的204个玉米大斑病菌菌株进行了生理小种鉴定;利用毒力频率法分析玉米大斑病菌的生理分化及其在中国的分布频率。结合前人研究结果,分析了近30年中国玉米大斑病菌生理小种变化趋势。共鉴定出0,1,2,3,12,13,23,123,23N共9个生理小种,其中0号小种和1号小种为优势小种,...

为建立一套全面的制备玉米大斑病菌完整染色体的制备体系,以玉米大斑病菌菌株F124为供试菌株,比较了冷冻液氮研磨法、直接包埋法、原生质体包埋法制备玉米大斑病菌完整染色体的效果。结果发现:使用直接包埋法不能从玉米大斑病菌中提取染色体;冷冻液氮研磨法得到的染色体是不完整的;原生质体法提取出了完整的染色体,是最适合制备完整染色体的方法。并且用原生质体法提取该菌株的染色体脉冲场电泳技术初步分离,首次得到了2条大于2200 kb的染色体条带。

【目的】明确四川省玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)自然群体的交配型和有性态形成能力(育性),探索小斑病菌有性生殖在自然界发生的可能性。【方法】利用多重PCR技术对2013—2018年间采自四川和云南的玉米小斑病菌的交配型进行检测,通过相反交配型菌株的两两杂交筛选一对高配合力的菌株作为标准菌株,采用与标准菌株对峙的方法对待测田间菌株进行育性测定,以假囊壳及子囊的形成情况判定菌株的育性水平。【结果】544株玉米小斑病菌中交配型MAT1-1菌株286株,交配型MAT1-2菌株258株,出现频率分别为52.57%和47.43%。卡方检验两种交配型的比例符合1﹕1的分离比(χ2=1.441,P=0.230),未出现偏离。两种交配型菌株在各采样区均有分布,不同年份间交配型结构基本一致。筛选得到MSRS-2-3(MAT1-1)和DY-12-1-2(MAT1-2)作为一对标准菌株,与标准菌株杂交能够产生子囊孢子的可育菌株比例为88.79%,不能产生子囊孢子的不育菌株比例为11.21%。可育菌株中存在育性的分化,高育性、中等育性和低育性菌株分别占测试菌株的12.32%、27.39%和49.08%。采自不同年份、不同地区的小斑病菌育性结构存在差异,2013—2018年可育菌株率分别为77.88%、78.57%、93.33%、94.87%、93.49%和88.76%。云南西双版纳地区的菌株可育率最高,达到100%;其次为四川北部、中部、南部和东部地区,菌株可育率分别为93.25%、89.87%、83.33%和79.31%;四川西部地区菌株可育率最低,为69.23%。【结论】玉米小斑病菌自然群体中普遍存在MAT1-1和MAT1-2两种交配型,两种交配型均衡分布且多为可育菌株。尽管未见自然条件下玉米小斑病菌有性世代的报道,但两种交配型菌株和高比例可育菌株的普遍存在表明有性生殖可能正在发生。

大斑病是一种世界性玉米叶部病害,可造成玉米产量严重降低,其致病菌大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)可在叶片形成坏死斑,影响玉米品质并造成严重经济损失。效应分子在植物病原真菌对植物侵染过程中发挥着重要作用。根据玉米大斑病菌Et28A菌株全基因组信息,利用Signal P、TMHMM、Protcomp、big-PI Predictor和TargetP生物信息学软件和预测程序对玉米大斑病菌中11698条蛋白序列进行候选效应分子预测,再通过对上述蛋白半胱氨酸含量、信号肽长度及冗余性分析,获

【目的】从全基因组水平鉴定玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)的MAPK超家族基因,并对其进行系统进化、基因结构、多重序列比对及保守位点分析,构建玉米大斑病菌中的MAPK级联途径模型,为深入研究该植物病原菌中MAPK级联途径的功能奠定基础。【方法】利用玉米大斑病菌基因组数据库,通过基于隐马尔科夫模型的HMMER 3.0软件搜索基因组,鉴定并获得MAPK超家族成员序列、基因组定位信息;采用MEGA 5.0软件进行系统进化分析;通过GSDS工具进行基因结构分析;利用ClustalX、MEME工具分析MAPK蛋白激酶区的保守性及保守位点。【结果】在玉米大斑病菌基因组中发现了4个M...

【目的】开发一种可同时检测黄瓜靶斑病菌（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ ＣａｓｓｉｉＣｏｌａ）、黄瓜炭疽病菌（ＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉＣｈｕｍ ｏｒｂｉＣｕｌａｒｅ）和黄瓜细菌性角斑病菌（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｌａＣｈｒｙｍａｎｓ）的三重ｐＣｒ快速检测方法。【方法】根据ｉｔｓ或１６ｓ ｒ ｄｎａ序列分别设计黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌特异性检测引物；通过鉴定引物的特异性，筛选可在目标菌株中扩增出特异片段的特异引物；选择可以组合的３种病原菌特异性引物进行三重ｐＣｒ，对引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数分别进行优化，优化三重ｐＣｒ体系。【结果】针对黄瓜靶斑病菌、．．．

利用提取的玉米小斑病菌C小种(Helminthosporium maydis race C,HMC)毒素处理同核异质体Mo17-C和Mo17-N叶片及叶片中的原生质体并进行凋亡检测。叶片凋亡检测采用DNA凝胶电泳分析,结果表明:Mo17-C和Mo17-N均出现DNA-ladder,其中HMC毒素质量浓度为250μg/mL时,诱导12 h后Mo17-C出现的DNA-ladder最明显,而Mo17-N在HMC毒素质量浓度升至300μg/mL时,诱导12 h后DNA-ladder才最明显。原生质体的凋亡检测采用Hoechst 33258荧光染色法并统计其凋亡率,结果表明:Mo17-C和Mo17-N均...

【目的】克隆玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）小分子热激蛋白（small heat shock protein,sHSP）基因，分析其结构及在病菌发育和HT-毒素诱导过程中的表达模式。【方法】利用隐马尔可夫模型（hidden Markov model,HMM）筛选玉米大斑病菌全基因组范围内的sHSP家族成员，采用PCR技术克隆玉米大斑病菌01-23菌株的sHSP，通过生物信息学方法进行sHSP的理化性质分析、亚细胞定位、结构预测和系统发育分析，RNA-Seq和RT-qPCR分析sHSP在玉米大斑病菌不同发育阶段和HT-毒素诱导过程中的表达情况。【结果】从玉米大斑病菌基因组筛选到3个sHSP家族成员（StHSP37.2、StHSP37.0和StHSP22.6），克隆了01-23菌株中3个sHSP的DNA序列，编码的sHSP蛋白均属于弱酸、亲水蛋白，无跨膜结构域和信号肽；二级结构中无规则卷曲占58.97%—60.35%，而β-转角仅为2.69%—7.83%；亚细胞定位预测StHSP37.2和StHSP37.0位于细胞核，而StHSP22.6位于细胞核和细胞质；均含有近C端的ACD＿sHSP-like结构域，StHSP37.2、StHSP37.0和StHSP22.6分别有2、3和5个保守基序；利用SWISS-Model和AlphaFill构建了sHSP单体的三级结构模型；系统发育分析结果表明，StHSP22.6与链格孢（Alternaria alternata）、StHSP37.2和StHSP37.0与玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）的sHSP亲缘关系较近；玉米大斑病菌sHSP在菌丝中表达量最高，其次为芽管、附着胞和侵入钉，在分生孢子中表达量最低；StHSP22.6和StHSP37.2与玉米大斑病菌HT-毒素诱导显著负相关，在14 d时相对基因表达量分别上调6.45和18.12倍，21、28 d时StHSP37.2表达量仅上调2.56、1.78倍，而StHSP22.6表达量与WT无显著差异；StHSP37.0与HT-毒素诱导显著正相关，14、21和28 d时相对基因表达量分别下调59.23%、86.30%和88.11%；通过与玉米大斑病菌sHSP显著相关的表达基因挖掘，推测StHSP37.2和StHSP22.6主要与HSP90、HSP104、分解代谢及线粒体Mg2+转运有关，而StHSP37.0主要与液泡碱性氨基酸转运、有机合成和分泌有关。【结论】玉米大斑病菌sHSP家族成员既具有高度保守性，又与其他sHSP有结构和系统发育的差异性；不仅与玉米大斑病菌菌丝、芽管、附着胞和侵入钉发育相关，在HT-毒素诱导过程中也发挥重要调控作用。