【目的】玉米大斑病(northern leaf blight of corn)是由玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)引起的一种威胁玉米生产的重要叶部病害。本研究旨在确定影响玉米大斑病菌分生孢子产量的主要因素;明确GATA家族成员基因在分生孢子形成时期的表达特征,为深入解析调控病菌发育及致病的分子机制打下基础。【方法】以玉米大斑病菌野生型菌株01-23为试材,探索13种不同培养基(乳糖酪蛋白琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、玉米茎秆葡萄糖琼脂培养基、玉米茎秆琼脂培养基、玉米叶片葡萄糖

【目的】从全基因组水平上鉴定玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)Homeobox转录因子家族及其分布,阐明该家族的序列及进化特征,分析该家族基因在病菌不同生长发育时期的表达规律。【方法】利用生物信息学手段搜索玉米大斑病菌全基因组数据库,鉴定Homeobox转录因子家族;采用MEGA 5.0软件进行系统进化树分析;利用在线工具GSDS(gene structure display server)(http://gsds1.cbi.pku.edu.cn/index.php)绘制基因结构图;

【目的】确定玉米大斑病菌转录因子StSte12在基因组中的位置,分析目的蛋白质StSte12的结构特征;明确StSTE12在病菌不同发育时期的表达情况;筛选可能受StSte12转录因子调控的基因,分析其匹配序列的结构特征,并比较它们在病菌的中表达情况。【方法】利用生物信息学方法,确定StSte12在玉米大斑病菌基因组中的位置并解析目的蛋白质StSte12的结构特征;利用Western blot技术分析StSTE12在病菌不同发育时期的表达规律;根据酿酒酵母Ste12转录因子的下游调控基因,筛选病菌中可能受StSte12调控的功能基因;并利用生物信息学方法得出下游调控基因的结合位点;利用RT-P...

磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)通过降解细胞膜上的磷脂分子产生IP3和DAG两个第二信使分子,分别激活下游的Ca2+途径和蛋白激酶C。研究表明,PLC与植物病原真菌的致病及发育过程有关。利用PLC特异性抑制剂U-73122初步研究了玉米大斑病菌PLC的功能。结果显示,U-73122对玉米大斑病菌菌丝生长及分生孢子的萌发均具有明显的抑制作用,且抑制率随抑制剂浓度升高而增强;并且可引起芽管的缩短和不规则膨大。此外,U-73122也可以导致病菌粗毒素的生物学活性明显降低。由此说明PLC可以通过影响菌丝及芽管的极性生长,而调控玉米大斑病菌的菌丝及分生孢子发育;同时参与病菌的毒素合成。

为了阐明玉米大斑病菌几丁质合成酶基因StCHS6在病菌生长发育及致病过程中的作用,克隆并解析了该基因及其编码蛋白的结构特征,明确了该基因在病菌生长发育过程中的表达模式。在玉米大斑病菌1号小种菌株01-23中克隆StCHS6,利用生物信息学手段分析该基因的结构特征,并利用已有的病菌重要发育阶段的RNA-Seq数据库信息,明确该基因的表达模式。结果发现,StCHS6位于病菌基因组scaffold_1:2066293-2069876(-)的位置,基因全长为3 584 bp,含有4个内含子和5个外显子;CDS序列大小为2 703 bp,编码900个氨基酸,脂肪指数为81.86,亲水性平均值为-0.178,等电点(PI)为8.36,不稳定指数为36.94,属于碱性稳定型蛋白;保守结构域分析表明,StCHS6蛋白含有几丁质合成酶催化结构域Chitin_synth_1和多个跨膜结构域;亚细胞定位分析推测该蛋白定位于细胞膜上;RNA-Seq数据分析表明,StCHS6在菌丝、分生孢子、芽管、附着胞和侵入钉5个发育时期均有表达,但其表达量有所差异。以芽管时期的表达量为1,菌丝、分生孢子、附着胞和侵入钉时期的表达量分别为芽管时期的3.80,4.97,3.40,2.60倍。为阐明玉米大斑病菌StCHS6的基因结构特征、表达模式及功能奠定了基础。

碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子蛋白是一类在动植物及微生物中结构和功能均具有保守性的转录调控因子，为明确bZIP类转录因子在植物病原真菌中的功能及作用机制，进一步确定其与病菌生长发育及致病性的关系，以玉米大斑病菌01-23为材料克隆得到了StbZIP9基因(GenBank No.XM＿008032179.1),StbZIP9是bZIP转录因子家族成员之一，对该基因结构及蛋白质特征分析结果显示，该基因全长788 bp,开放阅读框为726 bp,编码241个氨基酸，其编码蛋白包含一个在真菌中高度保守的同源结构域BRLZ;对该基因在病菌生长发育及侵染宿主过程的RNA-seq数据进行分析，发现与菌丝时期相比StbZIP9在附着胞和芽管时期表达量升高2～4倍，在侵染玉米叶片24,72 h后基因表达从无到有且持续升高，表明StbZIP9与附着胞发育和芽管形成相关联并在病菌侵染宿主细胞过程中发挥重要作用；进一步利用生物信息学技术预测其结合保守基序及调控的靶基因，结合基序为NNTWACGTNN,包含bZIP类转录因子识别核心序列ACGT,并根据该序列预测StbZIP9下游靶基因，结合RNA-seq数据进行表达模式分析得到4个下游靶基因(JGI数据库中蛋白ID分别为：132893、163024、162798、40466),功能注释表明，其参与细胞壁组分聚合和运输、侵染宿主、孢子休眠等多种生物过程。为进一步阐明其在参与调控病菌侵染寄主的分子机制提供依据。

为明确玉米大斑病菌StRTG2基因功能以及其在病菌不同发育时期的表达模式。利用酵母ScRTG2基因编码的氨基酸序列进行BlastP,在玉米大斑病菌中得到了其同源基因序列,将其命名为StRTG2;分别以玉米大斑病菌野生型01-23的全基因组DNA及cDNA为模板,对该基因进行克隆;利用生物信息学技术对该基因编码的蛋白StRtg2进行理化性质分析、结构域预测、亚细胞定位预测;利用MEGA 7.0对Rtg2进行进化关系分析;扩增目的片段的ORF序列,构建该基因原核表达载体,通过转化大肠杆菌BL21后,使用IPTG进行诱导表达;最后利用RNA-Seq数据库分析StRTG2基因在玉米大斑病菌关键生长发育时期(菌丝、分生孢子、芽管、附着胞和侵入钉)的表达模式。主要研究结果如下:克隆了该基因发现其长度为1 695 bp,不含有内含子;该基因编码的蛋白由564个氨基酸组成,理论等电点值(pI)是6.96,具有典型的Ppx-Gppa保守结构域,亚细胞定位预测结果显示,该蛋白在细胞各部位均有分布,分布于细胞质中的可能性最大;对该蛋白进行进化关系分析表明,玉米大斑病菌StRtg2蛋白与番茄匍柄霉菌中同源蛋白的同源性最高,其次是酿酒酵母;原核表达该基因,SDS-PAGE胶显示该蛋白的大小约为62 ku,与预期大小相符;表达模式分析发现,该基因在病菌发育的5个时期均有表达,其中芽管和侵入钉时期表达量显著降低。为进一步解析StRTG2基因的功能研究奠定基础。

【目的】小柱孢酮脱水酶（scytalone dehydratase,SCD）是黑色素合成过程中的关键酶。本文旨在鉴定玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）小柱孢酮脱水酶基因（StSCD）家族，并分析玉米大斑病菌附着胞发育过程中StSCD基因家族表达量差异及SCD抑制剂对黑色素合成的影响，为进一步研究StSCD基因家族在黑色素合成和附着胞发育中的作用打下基础。【方法】利用玉米大斑病菌野生型菌株01-23的全基因组数据，获得StSCD基因家族的全序列，并与玉米小斑病菌（Cochlibolus heterostrophus）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、瓜类炭疽病菌（Colletotrichum lagenaria）等真菌的SCD进行序列比对；收集玉米大斑病菌附着胞不同发育时期的材料进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析，获得不同时期、不同StSCD的表达量，从而确定与病菌侵染和附着胞黑色素化密切相关的脱水酶基因；使用SCD抑制剂环丙酰菌胺处理玉米大斑病菌，测定菌落生长速度、黑色素合成量、附着胞膨压等，确定StSCD在附着胞发育过程中的作用。【结果】玉米大斑病菌全基因组中共鉴定到4个StSCD，其编码蛋白具有SCD保守结构域及保守的催化及底物结合氨基酸残基。StSCD3与灰葡萄孢（Botrytis cinerea）中功能冗余的SCD2蛋白具有较高同源性，StSCD4与多主棒孢（Corynespora cassiicola）中参与黑色素合成的SCD蛋白具有较高同源性。通过分析玉米大斑病菌生长发育过程中不同时期StSCD的表达量发现，在附着胞时期4个StSCD表达量均上调，其中StSCD3、StSCD4表达量上调尤为显著，附着胞再生菌丝时期StSCD3、StSCD4的表达量均显著下降，并且在附着胞诱导整个时期StSCD4的表达量较高。环丙酰菌胺处理玉米大斑病菌后，黑色素合成受阻，附着胞膨压显著降低。【结论】玉米大斑病菌含有4个StSCD，推测StSCD4参与DHN(1,8-间苯二酚)黑色素的合成，并进而影响附着胞膨压积累。

【目的】对玉米大斑病菌（ＳｅｔｏＳｐｈａｅｒｉａ ｔｕｒｃｉｃａ）漆酶基因Ｓｔｌａｃ２进行生物信息学分析，推测其蛋白功能，探究木质素降解过程中产生的小分子物质对Ｓｔｌａｃ２表达的影响，并对其进行克隆及原核表达，以便深入研究该基因在病菌生长、发育及致病过程中的作用。【方法】通过ＮｃＢｉ查询获得玉米大斑病菌ｅｏａ９００７０（Ｓｔｌａｃ２）基因的全序列，通过ｃｌｕＳｔａｌ Ｘ与马尔尼菲青霉菌（ｐｅＮｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒＮｅｆｆｅｉ）ｐＢｒＢ（ｐｍａａ＿０８２０６０）基因、烟曲霉（ａＳｐｅｒｇｉｌｌｕＳ ｆｕｍｉｇａｔｕＳ）ａＢｒ２（ａｆｕａ＿２ｇ１７５３０）基因、构巢曲菌（ａＳｐｅｒｇｉｌｌｕＳ．．．

【目的】克隆玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）小分子热激蛋白（small heat shock protein,sHSP）基因，分析其结构及在病菌发育和HT-毒素诱导过程中的表达模式。【方法】利用隐马尔可夫模型（hidden Markov model,HMM）筛选玉米大斑病菌全基因组范围内的sHSP家族成员，采用PCR技术克隆玉米大斑病菌01-23菌株的sHSP，通过生物信息学方法进行sHSP的理化性质分析、亚细胞定位、结构预测和系统发育分析，RNA-Seq和RT-qPCR分析sHSP在玉米大斑病菌不同发育阶段和HT-毒素诱导过程中的表达情况。【结果】从玉米大斑病菌基因组筛选到3个sHSP家族成员（StHSP37.2、StHSP37.0和StHSP22.6），克隆了01-23菌株中3个sHSP的DNA序列，编码的sHSP蛋白均属于弱酸、亲水蛋白，无跨膜结构域和信号肽；二级结构中无规则卷曲占58.97%—60.35%，而β-转角仅为2.69%—7.83%；亚细胞定位预测StHSP37.2和StHSP37.0位于细胞核，而StHSP22.6位于细胞核和细胞质；均含有近C端的ACD＿sHSP-like结构域，StHSP37.2、StHSP37.0和StHSP22.6分别有2、3和5个保守基序；利用SWISS-Model和AlphaFill构建了sHSP单体的三级结构模型；系统发育分析结果表明，StHSP22.6与链格孢（Alternaria alternata）、StHSP37.2和StHSP37.0与玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）的sHSP亲缘关系较近；玉米大斑病菌sHSP在菌丝中表达量最高，其次为芽管、附着胞和侵入钉，在分生孢子中表达量最低；StHSP22.6和StHSP37.2与玉米大斑病菌HT-毒素诱导显著负相关，在14 d时相对基因表达量分别上调6.45和18.12倍，21、28 d时StHSP37.2表达量仅上调2.56、1.78倍，而StHSP22.6表达量与WT无显著差异；StHSP37.0与HT-毒素诱导显著正相关，14、21和28 d时相对基因表达量分别下调59.23%、86.30%和88.11%；通过与玉米大斑病菌sHSP显著相关的表达基因挖掘，推测StHSP37.2和StHSP22.6主要与HSP90、HSP104、分解代谢及线粒体Mg2+转运有关，而StHSP37.0主要与液泡碱性氨基酸转运、有机合成和分泌有关。【结论】玉米大斑病菌sHSP家族成员既具有高度保守性，又与其他sHSP有结构和系统发育的差异性；不仅与玉米大斑病菌菌丝、芽管、附着胞和侵入钉发育相关，在HT-毒素诱导过程中也发挥重要调控作用。

【目的】克隆玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)Gα亚基(Heterotrimeric Gproteinalpha subunit)基因及其启动子,并对其进行异源表达,为深入研究Gα基因的表达规律、基因功能和编码蛋白的特性奠定基础。【方法】首先通过简并引物PCR法获得Gα基因的同源片段,再利用Genome walking技术克隆片段的5′端和3′端侧翼序列,最后采用RT-PCR法扩增基因全长,并对基因结构和上游调控元件进行生物信息学分析。同时,利用pET原核表达系统获得基因的编码产物。【结果】获得1个玉米大斑病菌Gα基因—Stga-2的全长序列及其上游部分启动子区,并利用p...

【目的】克隆蛋白激酶C基因(PKC)及其启动子,验证该基因拷贝数,同时对PKC的表达规律进行研究,了解该基因在信号转导途径中的激活条件,为进一步研究该基因的功能奠定基础。【方法】首先通过简并引物PCR法获得PKC的同源片段,再利用Genome walking技术克隆片段的3′端和5′端侧翼序列,采用RT-PCR法扩增基因全长,并对基因结构和上游调控元件进行生物信息学分析。利用Southern blotting验证基因拷贝数。最后,利用半定量RT-PCR技术研究玉米大斑病菌在不同碳源、氮源培养以及非生物胁迫条件下,PKC的表达量的变化规律。【结果】获得PKC全长序列及其上游部分启动子区,生物信息...

为了明确StSNF1在玉米大斑病菌基因组中的位置,解析该基因编码蛋白的结构特征,探究该基因在侵染寄主的不同时期、分生孢子萌发侵染过程中以及不同碳源培养下的表达情况。结果表明,该基因ID号为008026214,全长3 046 bp,位于scaffold_17负链的97 793-100 838位置。StSNF1与玉米圆斑病菌SNF1同源关系较近,由877个氨基酸残基编码而成。StSNF1蛋白具有氮端的蛋白激酶结构域、氮端的碳代谢产物去阻遏蛋白激酶结构域和碳端的激酶相关结构域。在蛋白激酶结构域内,具有ATP结合

[目的]分析玉米大斑病菌寄主选择性毒素(host selective toxin,HST)生物合成基因簇Cluster 397.3的结构,以及该基因簇组成基因在玉米大斑病菌侵染过程中的表达情况,为玉米大斑病菌HST的结构和功能研究奠定基础。[方法]以玉米大斑病菌23号生理小种et28a和01-23菌株,1号生理小种ny001和01-11菌株,玉米感病自交系B37为材料,利用antiSMASH技术预测玉米大斑病菌次生代谢产物合成基因簇,通过Synteny共线性分析获得玉米大斑病菌HST生物合成基因簇Cluster 397.3,并对其基因组成和结构进行分析,再利用RNA-Seq技术分析该基因簇的组成基因在玉米大斑病菌侵染玉米叶片3,5,7,10 d的表达情况。[结果]玉米大斑病菌次生代谢产物合成基因簇Cluster 397.3与交链链格孢(Alternaria alternata) ACT-毒素合成基因簇有保守的共线性,含有1个聚酮合酶(PKS)、1个氨基甲酰磷酸合成酶(CPS)、1个短链脱氢酶/还原酶(SDR)、1个锌结合氧化还原酶(ZOR)、1个保守假定蛋白(CHP)、2个细胞色素P450(P450)及2个耐药转运蛋白(DRT)等9个基因。其中PKS与ACT-毒素合成酶基因ACTTS3同源,编码的聚酮合酶包括PksD、PS-DH、Methyltransf_12、PKS_KR、PKS_NbtC superfamily和NADB_Rossmann superfamily 6个典型结构域。RNA-Seq分析结果表明,将玉米大斑病菌接种玉米叶片3,5,7,10 d后,Cluster 397.3组成基因均能表达,且以3 d时表达量整体较高;除CHP基因外,01-11菌株中基因表达量均显著高于01-23菌株。[结论]Cluster 397.3基因表达差异与玉米大斑病菌生理小种的分化和致病特异性有关,该基因簇可能参与了玉米大斑病菌寄主选择性毒素的生物合成。

【目的】分析玉米大斑病菌StSte12的结构、转录活性及功能。【方法】利用生物信息学方法,对获得的StSte12进行保守结构域和进化树分析,推测该基因的功能;利用β-半乳糖苷酶法检测StSte12的转录活性;将StSTE12转化至酿酒酵母ScSTE12基因缺失突变体ste12Δ中,筛选酿酒酵母ScSTE12的功能互补突变体并对其分析,验证玉米大斑病菌StSTE12的功能。【结果】通过蛋白比对发现StSte12具有转录因子特有的STE homeodomain和ZnF_C2H2锌指结构;同源性分析显示,该基因与其它植物病原真菌的STE12-like基因有较高的同源性;利用β-半乳糖苷酶法检测发现,...