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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王金香 蒋明义 马芳芳 丁海东
以玉米(Zea mags L.)为材料,利用RT-PCR和RACE技术,从ABA处理的玉米叶片中克隆了1个新的A族促分裂原激活蛋白激酶(MAPK)基因,命名为ZmMPK7(GenBank登录号:EU616650)。生物信息学分析表明:该基因全长1 709 bp,编码397个氨基酸,推测相对分子质量为44.9×103,pI 5.31。ZmMPK7包含有MAP激酶11个相对保守结构域和1个TEY的磷酸化基序。对玉米不同组织中ZmMPK7基因的转录水平分析表明:ZmMPK7基因的转录没有组织专一性。非生物胁迫处理下ZmMPK7基因表达研究发现:ABA、H2O2、干旱、盐胁迫、低温及重金属处理均诱导Z...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵巍 王茜 郝志敏 王青 宋文静 韩建民 董金皋
【目的】克隆蛋白激酶C基因(PKC)及其启动子,验证该基因拷贝数,同时对PKC的表达规律进行研究,了解该基因在信号转导途径中的激活条件,为进一步研究该基因的功能奠定基础。【方法】首先通过简并引物PCR法获得PKC的同源片段,再利用Genome walking技术克隆片段的3′端和5′端侧翼序列,采用RT-PCR法扩增基因全长,并对基因结构和上游调控元件进行生物信息学分析。利用Southern blotting验证基因拷贝数。最后,利用半定量RT-PCR技术研究玉米大斑病菌在不同碳源、氮源培养以及非生物胁迫条件下,PKC的表达量的变化规律。【结果】获得PKC全长序列及其上游部分启动子区,生物信息...
[期刊] 华北农学报
[作者]
边鸣镝 吴忠义 张秀海 王永勤 曹鸣庆 黄丛林
应用电子克隆的方法获得了玉米的一个Pti1(Pto-interacting 1)同源基因的全长cDNA,命名为ZmPti1-1(Gen-Bank接受号为EF158035)。推断ZmPti1-1蛋白含有362个氨基酸,分子量为39.00 kDa,pI为8.14,包含蛋白激酶催化结构域保守的11个亚结构域。在水杨酸(Salicylic acid,SA)、甘露醇、氯化钠、脱落酸(Abscisic acid,ABA)和4℃低温的诱导下,ZmPti1-1在玉米幼苗叶片中的表达量明显上调。同时,在玉米不同发育时期、不同组织器官内,ZmPti1-1的表达水平也有很大差异,在子房中表达量最高,在雄蕊中检测不到...
关键词：
玉米 Pti1 生物胁迫 非生物胁迫
[期刊] 水产学报
[作者]
郑碧琪 刘学良 黄辉洋 巩杰 叶海辉
采用qRT-PCR、RACE等方法,获得了拟穴青蟹丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)基因cDNA全长序列。该基因全长1 558 bp,开放阅读框长度为1 224 bp,编码407个氨基酸残基。同源分析显示,该基因编码的蛋白与昆虫的相似性高达70%,推测MAPKK基因在节肢动物具有较高的保守性。经荧光定量PCR检测,MAPKK基因在拟穴青蟹多个组织中有表达,且在脑神经节和卵巢中表达量较高。在拟穴青蟹卵巢发育过程中,MAPKK基因在卵巢发育期(Ⅲ期)表达量最高,发育期为卵母细胞快速生长期,推测MAPKK具有促进卵母细胞快速生长的作用。
[期刊] 华北农学报
[作者]
陈倩 杨尚谕 卓维 李佳皓 彭双 王静 李立芹
为了研究烟草中蛋白激酶CIPK3在植物非生物胁迫应答中的功能,通过同源克隆的方法,在普通烟草品种K326中克隆到1个CIPK家族基因NtCIPK3。利用生物信息学软件对该基因编码蛋白的结构和功能进行了预测分析。该基因包含一个1 272 bp的开放阅读框,编码423个氨基酸残基。蛋白序列分析表明,该蛋白含有一个跨膜结构域,且平均疏水性系数小于0,属于亲水性膜蛋白。蛋白比对分析发现,NtCIPK3含有高度保守的N端激酶区、连接区以及C端调控区,与野生烟草CIPK3的同源性最高,达99%。亚细胞定位预测显示,该蛋白主要定位于细胞核,且具有双分型的核定位信号序列。运用qRT-PCR技术,对该基因的表达特性进行了分析,组织表达分析发现,该基因在烟草的根、茎、叶、花中均有表达,但在叶中表达水平明显高于其他组织,推测可能主要在叶中行使功能。NtCIPK3基因在不同程度上受低钾、高盐、干旱、ABA、H_2O_2、低温处理的诱导,推测NtCIPK3基因在烟草的非生物胁迫应答反应中发挥了重要作用。并成功构建pBI121-NtCIPK3过表达载体,为今后该基因在非生物胁迫下的功能研究奠定了基础。
[期刊] 水产学报
[作者]
涂淏天 房晓宸 梁海鹰 雷倩楠 刘德凡
丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该蛋白激酶通过磷酸化级联介导的信号通路在细胞对细胞外刺激的反应中起着重要作用。本研究利用cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术克隆获得马氏珠母贝MAPK p38(PmMAPK p38) cDNA 全长序列并对其序列进行生物信息学分析；利用实时荧光定量 PCR(qPCR)技术分析了PmMAKP p38在马氏珠母贝不同组织以及不同免疫刺激后的表达水平。结果显示，PmMAKP p38 cDNA全长为1 516 bp，开放阅读框长度为1 071 bp，共编码356个氨基酸，理论分子量为 40.88 ku；结构域预测结果表明PmMAPK p38含有MAPK家族典型的S＿TKc结构域；多序列比对、进化树构建以及MatGAT计算结果显示PmMAPK p38与其他物种的相似度、保守程度较高；荧光定量分析结果表明，该基因在马氏珠母贝中存在广泛表达，在肝胰腺中表达量最高，其次为外套膜，最低是闭壳肌。马氏珠母贝在受到LPS刺激后，PmMAKP p38的相对表达量在刺激后2 h达到最高，12 h降到最低，最高约为最低的5倍；而在哈维氏弧菌刺激后，PmMAKP p38的相对表达量在2 h达到最高，8 h降到最低，最高约为最低的4倍。研究表明，PmMAPK p38可能在马氏珠母贝的免疫反应，尤其是在抵御外部细菌侵入中起着重要的作用。本研究为贝类免疫防御系统的研究提供了基础资料。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
杨娇馥 史偈君 梁燕 郑旭 张涛 秦毅 王志钢 刘东军
【目的】克隆内蒙古白绒山羊AKT基因cDNA并分析其基本表达模式。【方法】RT-PCR克隆AKT基因cDNA。通过在线软件BLAST进行核酸序列分析,用SMART与Psite进行氨基酸序列分析。半定量RT-PCR检测AKT基因在绒山羊组织中的表达特异性。Western blotting检测绒山羊胎儿成纤维细胞中AKT表达。【结果】克隆到的内蒙古白绒山羊AKT基因cDNA片段长1 443 bp,包含了编码480个氨基酸残基的全长ORF,氨基酸序列与绵羊(NM_001161857.1)同源性为97%。SMART分析表明,ORF编码的蛋白包含了可与3-磷酸肌醇结合的PH结构域及具有丝氨酸/苏氨酸激酶...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王莹 王晓宇 孙德慧 霍红雁 刘海臣 徐惠 张继星
为探讨蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29)在蓖麻耐盐中的作用，以蓖麻叶片为材料，设计特异性引物，克隆蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29),并对所得序列进行生物信息学分析。结果表明，蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29)序列全长1 590 bp;编码528个氨基酸；蛋白分子量为59.74 ku;等电点(pI)值6.21;是典型的非跨膜蛋白；亲水性数值为负值，属于亲水性蛋白；RcCDPK29蛋白α-螺旋占比最高有228个；RcCDPK29与拟南芥CDPK(SMTL ID:3q5i.1)相似度为40.41%,具有较高可信度(>30%)。将木薯、麻枫树、巴西橡胶树、柑橘、石榴、毛果杨与蓖麻RcCDPK29氨基酸序列进行同源性比对。其中，与麻枫树的同源性最高，为82.29%。RcCDPK29蛋白包含1个Ser/Thr蛋白激酶催化结构域和4个与Ca~(2+)结合的EF-hand型结构域。通过qRT-PCR技术，分析RcCDPK29在不同水平盐胁迫下蓖麻不同组织中的表达，结果表明，RcCDPK29基因主要在茎中表达，盐处理12 h表达量最高。随着盐处理时间的延长，RcCDPK29基因根的表达量逐渐下降，分别在2,8,24 h达到最低，与0 h差异显著；叶的表达量在2 h的表达量最低且与0 h相比差异显著。根据RcCDPK29全长设计带有SmaⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物扩增出序列全长，用SmaⅠ和XbaⅠ进行双酶切后与表达载体pCG-3300连接。成功构建了CRcCDPK29的表达载体。因此，RcCDPK29在蓖麻受到盐胁迫时起重要作用。
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨煜 郭晓 郭宝太 杨晓慧 单伟伟 金黎平 马伟清 李广存
以高抗青枯病二倍体马铃薯基因型ED13为材料,克隆了蛋白激酶基因StPki。以StPki基因特异区段为靶标,成功构建了该基因的RNA干扰植物表达载体pCHF1-StPki。利用重组农杆菌株LBA4404(pCHF1-StPki)感染转化ED13茎段外植体,获得了抗庆大霉素的再生植株。利用CaMV35S启动子特异引物对再生植株进行PCR检测,结果表明获得了转基因植株。利用StPki基因的特异引物对转基因植株进行半定量RT-PCR分析,结果显示该基因的转录受到了抑制。马铃薯抗病基因型ED13已被成功转化,且表现出了对StPki基因的RNA干扰活性。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王呈玉 张明哲 吕世友 李彦舫
【目的】克隆强抗寒性牧草短芒大麦钙依赖蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase,CDPK)基因,分析其生理生化特性,为理想抗逆工程基因的筛选和利用奠定基础。【方法】采用RACE-PCR技术,获得短芒大麦CDPK基因全长cDNA序列;采用Northern杂交分析该基因在逆境条件下(低温(4℃)、干旱(200 g/L PEG6000)、盐(300 mmol/L NaCl)、激素(100μmol/L ABA))的表达模式;采用农杆菌介导的方法,对该基因编码蛋白进行亚细胞定位,并对转基因烟草的离子渗漏率和脯氨酸含量进行测定。【结果】获得了短芒大麦CDPK基因的编码序列...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王华夏 顾峰 廖瑛 茅翔 丁铲 范红结
[目的]本文旨在探究新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染过程中细胞因子显著上调的机制。[方法]NDV感染He La细胞,用RT-PCR法检测IFN-β、IL-6、IL-8 mRNA水平。Western blot分析和免疫荧光分析检测NDV对双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)与NF-κB信号通路的影响。[结果]与未感染组相比,IFN-β、IL-6、IL-8 mRNA水平显著上调。NF-κB信号通路在感染后1224 h被激活,转录因子p65入核,而使用NF-κB信号通路抑制
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张博文 赵丽雯 徐璐 李盼 曾凡力 孟亚南 董金皋
【目的】Cks1(cyclin-dependent kinase subunit 1)是细胞周期蛋白依赖性激酶复合体CDK(cyclin-dependent kinase)的结构亚基，是细胞周期调控过程中的关键基因。论文旨在鉴定玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）StCks1，分析玉米大斑病菌附着胞发育过程中StCks1表达量差异及其互作蛋白，为进一步研究StCks1在附着胞发育中的作用打下基础。【方法】通过对玉米大斑病菌野生型菌株01-23全基因组数据分析，获取StCks1蛋白序列；利用软件MEGA 5.0和在线数据库Pfam、SMART对酿酒酵母、裂殖酵母和拟南芥等物种Cks1蛋白进行系统发育树构建和保守结构域分析；收集玉米大斑病菌附着胞发育不同时期样品进行转录组测序以及表达量分析。利用原核诱导表达系统，构建原核表达载体pGEX-6p-3-StCks1，并转化大肠杆菌表达菌株BL21，对重组蛋白GST-StCks1诱导表达纯化；通过GST pull-down、Western blot技术和酵母双杂交试验，鉴定StCks1的互作蛋白。【结果】玉米大斑病菌全基因组中鉴定到唯一StCks1蛋白编码基因，该蛋白由130个氨基酸组成；其三级结构主要由4股β折叠和3个α螺旋构成，含有HxPEPH(His-anyPro-Glu-Pro-His)保守位点和Cks保守结构域；通过转录组测序和表达量分析发现，StCks1在附着胞发育不同时期表达量显著上调；重组蛋白GST-StCks1在1 mmol·L-1 IPTG,30℃诱导2 h可获得大量可溶性蛋白；通过GST pull-down技术获取大量互作蛋白并进行质谱鉴定，通过Western blot和酵母双杂交试验，验证StCks1与细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1存在互作。【结论】玉米大斑病菌中含有唯一的StCks1，通过与细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1互作调控附着胞的发育。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王秋金 肖国强 滕爽爽
泥蚶(Tegillarca granosa)作为我国常见的滩涂养殖贝类，具有较高的经济价值。以弧菌为代表的条件致病菌一直以来是困扰双壳贝类健康养殖的一大难题。为了探讨泥蚶感染弧菌过程中,c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)介导的激活蛋白-1(activating protein-1,AP-1)先天免疫防御通路的作用及机制,本研究采用PCR技术克隆了泥蚶JNK基因(TgJNK)的c DNA序列,并对TgJNK和TgAP-1在弧菌感染下的表达和调控关系进行了分析。结果显示, TgJNK基因c DNA全长2696 bp,开放阅读框1332 bp,编码了443个氨基酸;蛋白多重比较和邻近系统发育树分析表明, TgJNK相对保守,存在一个STKc-JNK结构域,与长牡蛎(Crassostrea gigas)和紫贻贝(Mytilus edulis)的同源相似度较高。q RT-PCR和WB结果表明TgJNK在泥蚶的鳃中表达最高。哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）的浸泡感染可显著上调TgJNK的转录水平(P
[期刊] 华北农学报
[作者]
石薇 黄丛林 张秀海 吴忠义 杨德光
通过花粉管通道法将ZmPti1,ZmPti1-1,ZmCIPK2三种蛋白激酶基因植物表达载体分别导入玉米自交系吉444,经草丁膦筛选后得40株抗性植株,通过PCR检测其中28株为PCR阳性植株,平均转化率为1.33%,最后收获11株转基因植株。干旱条件下通过对转基因T1植株的单株籽粒产量、千粒重两个指标进行差异显著性和耐旱系数的分析,结果表明,转基因植株与非转基因植株对干旱的敏感性不同,初步认为转基因植株具有抗旱性,表明蛋白激酶能够提高玉米的耐旱性。
[期刊] 华北农学报
[作者]
肖雪 张秀海 杨清 邹华文 吴忠义 于荣 曹鸣庆 黄丛林
为了研究玉米蛋白激酶ZmSPK1在植物体内亚细胞水平上的分布情况,利用绿色荧光蛋白基因gfp为报告基因,分别构建了以35S为启动子表达ZmSPK1-GFP融合蛋白和GFP的植物表达载体35S∷ZmSPK1-GFP和35S∷GFP,用花粉浸醮的方法将表达载体转入拟南芥,筛选稳定表达株系,在共聚焦激光扫描显微镜下观察ZmSPK1在植物细胞中的定位。研究结果表明:融合蛋白ZmSPK1-GFP的荧光分布与游离GFP相似,在细胞浆及细胞核内均可见。与单独表达GFP相比,融合蛋白ZmSPK1-GFP在核内信号更强,推测ZmSPK1是可溶性蛋白,定位在核内。
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