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[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
刘宝山 赵玉军 张交儿
根据GeneBank上的猫IFN-β基因序列,设计了1对特异性引物,对猫肝组织中提取的DNA进行PCR扩增,然后将扩增产物插入pUCm-T克隆载体进行了克隆。测序分析表明,克隆的IFN-β基因序列与GeneBank中的基因(NM_001009297)存在一个碱基差异,第446位碱基由T变为C,二者同源性高达99.82%,同时这个碱基的差异没有引起氨基酸的改变。将其双酶切后插入原核表达载体pGEX-KG,构建成功重组表达载体pGEX-IFNB,将其转化BL21(DE3)后成功进行了诱导表达。SDS-PAGE和Western-Blot分析表明,在35KDa处出现蛋白表达条带,表达量占菌体蛋白的12...
关键词：
β干扰素 猫 克隆 表达
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
曹瑞兵 周斌 陈德胜 陈溥言
提取经ConA诱导培养的猪外周血白细胞总RNA ,RT -PCR扩增出猪IFN -γ基因并克隆到pGEM -T -easy载体 ,测序结果表明扩增片段是含有信号肽的猪IFN -γ的完整基因。设计 1对引物亚克隆猪IFN -γ成熟蛋白基因并对其5′端前 2个稀有密码子进行大肠杆菌偏嗜性改造。经测序鉴定后插入原核表达载体pRLC ,并实现在大肠杆菌中的高效表达。表达产物以包涵体形式存在 ,经 7mol·L-1盐酸胍的变性液溶解及 0 5mol·L-1盐酸胍复性液复性处理 ,表达产物进行脱盐、凝胶层析纯化。细胞病变抑制法测定结果表明 ,重组猪IFN -γ具有较高的干扰素活性 ,约为 4 5× 1...
关键词：
猪γ干扰素 基因改造 原核表达 分离纯化
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
周勇 范玉顶 黄莉莉 曾宪辉 张雪萍 张琳琳 曾令兵
【目的】开展青鱼γ－干扰素（ＩＦＮ－γ）基因的克隆、结构特征与表达谱分析研究。【方法】采用ｃＤＮＡ末端快速扩增技术获得了青鱼（ＭｙｌｏｐｈＡｒｙＮｇｏＤｏＮ ｐＩｃｅｕｓ）ＩＦＮ－γ基因ｃＤＮＡ的５′和３′末端序列，然后根据其末端序列设计特异性引物，扩增得到青鱼ＩＦＮ－γ基因ｃＤＮＡ全长序列，对其序列和编码氨基酸序列进行生物信息学、同源性比较及系统进化树分析，同时对其在青鱼各组织中的表达进行分析。通过构建真核表达载体，将其转染青鱼鳍条组织细胞进行表达分析。【结果】青鱼ＩＦＮ－γｃＤＮＡ全长为８９５ｂｐ，其开放阅读框大小为５４９ｂｐ，编码１８２个氨基酸。氨基酸序列比对分析结果显示，青鱼ＩＦＮ－γ．．．
关键词：
青鱼 IFN-γ基因 结构特征 表达分析
[期刊] 华北农学报
[作者]
陈红英 宋凌云 崔保安 胡功政 贾艳艳 郭显坡
通过PCR技术从罗曼鸡肝脏基因组中扩增鸡α干扰素(ChIFN-α)全基因,并克隆和测序。序列分析表明,ChIFN-α基因全长为582 bp,亚克隆其成熟蛋白编码基因489 bp,利用基因重组技术构建了重组质粒,使ChIFN-α置于原核表达载体pQE30的T5启动子下并同6×His(多聚组氨酸标签)-Tag融合。经酶切和PCR鉴定,DNA测序证实重组质粒pQEChIFN-α构建正确;将pQEChIFN-α转化大肠杆菌M15感受态细胞,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Westernblot证实表达出分子质量为19.80 kDa的融合蛋白。表达的蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性处理后,在Ve...
关键词：
鸡 α干扰素 克隆 原核表达 抗病毒活性
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
高绍帅 唐紫雯 黎汕 程华琴 殷实 李键
[目的]克隆麦洼牦牛干扰素-τ(IFN-τ)基因,并检测其在麦洼牦牛不同组织和不同发情周期卵巢组织中的表达水平。[方法]采用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术克隆麦洼牦牛IFN-τ基因,测序后采用不同的生物信息学软件分析其同源性,并预测IFN-τ蛋白的结构和功能。以GAPDH基因为内参基因,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)检测麦洼牦牛心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、肌肉组织和处于不同发情周期(卵泡期、红体期、黄体期)卵巢组织中IFN-τ基因mRNA的表达水平。[结果]通过RT-PCR扩增得到长598 bp的麦洼牦牛IFN-τ基因,其开放阅读框大小为564 bp,编码氨基酸187个。IFN-τ蛋白二级结构中占比最大的为α-螺旋(50.8%),共有15个磷酸化位点,为整体带负电荷、不稳定的亲水性蛋白,其基因序列与大额牛、黄牛有较高的同源性。组织表达谱分析结果表明,麦洼牦牛小肠、肝脏组织中IFN-τ基因mRNA表达水平显著高于其他组织(P<0.05),卵泡期卵巢组织IFN-τ基因mRNA表达水平显著高于红体期和黄体期(P<0.05)。[结论]克隆了麦洼牦牛IFN-τ基因,该基因在麦洼牦牛卵泡期卵巢组织中的表达水平最高,提示其可能在卵巢早期发育过程中有一定作用。
关键词：
干扰素-τ 麦洼牦牛 卵巢 组织表达
[期刊] 中国水产科学
[作者]
尹经逵 史燕 朱新平
对斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)的干扰素调节因子(1Interferon regulatory factor1,IRF-1)基因进行了克隆、测序及原核表达。以PBS做对照,利用polyI:C刺激斜带石斑鱼,然后取其肝脏、头肾、脾脏提取总RNA,随机引物反转录获得cDNA。根据相近物种IRF-1的保守序列设计引物,通过PCR得到了保守片段,通过RACE-PCR获得了斜带石斑鱼IRF-1基因的全长cDNA。基因全长为1730bp,完整开放阅读框(ORF)906bp,编码302个氨基酸,5′非编码区153bp,3′非编码区671bp。将斜带石斑鱼ORF与其他物种进行比对发现,...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
曾翠平 王晓杜 戴汉川 龙良启 伍晓雄
将猪IFN-α(poIFN-α)成熟蛋白基因克隆于pET-28a载体中,转染大肠杆菌,并进行诱导表达。经SDS-PAGE检测,融合表达的蛋白poIFN-α大小约27 ku。收获融合表达的poIFN-α,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,通过间接ELISA方法对融合细胞进行检测,结果获得了1株能稳定分泌抗poIFN-α蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为2H12株。Western-blotting结果及单克隆抗体亚型鉴定结果表明,单抗与重组蛋白发生特异性反应,单抗为IgG1亚型,且轻链为κ链。
关键词：
猪 α-干扰素 原核表达 单克隆抗体
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张跃 白俊杰 李英华 叶星 简清 李新辉 罗建仁
采用逆转录—聚合酶链式反应 (RT -PCR)方法 ,从牙鲆 (Paralichthysolivaceus)肝脏总RNA中扩增出干扰素调节因子 (fIRF)的核心区序列。定向插入质粒 pUC18,克隆的牙鲆IRFcDNA序列分析表明 ,与Yabu报道的牙鲆IRFcDNA相比有 1个碱基差异 ,但与推断的氨基酸序列完全一致。将牙鲆IRF的核心区序列cDNA定向插入原核表达载体 pBV2 2 0 ,构建成牙鲆IRF表达载体pBVfIRF2 2。SDS -PAGE分析表明 ,经 4 2℃诱导 ,含 pBVfIRF2 2质粒的大肠杆菌可表达一分子量约 12 0 0 0的特异蛋白。
关键词：
牙鲆 干扰素调节因子 分子克隆 原核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
李富强 张小丽 马小军 罗秀刚 岳燕 姜力飞 王恩丽 时帅峰
运用RT-PCR和PCR技术克隆基因,应用DNAStar对获得的cDNA及推测的氨基酸序列进行分析。从合作猪脾脏组织中克隆IFN-γcDNA ORF全长501 bp,共编码166个氨基酸,N端具有由23个氨基酸组成的信号肽,该蛋白预测的分子质量为19.418 5 kDa,等电点为9.54,合作猪IFN-γ核苷酸序列上共发现9个磷酸化位点,分别为Ser(7)、Thr(1)、Tyr(1);2个N-糖基化位点,分别在第39位和第106位Asn处。序列比较结果表明,合作猪IFN-γ基因序列与藏猪、印度猪种、内江猪、牛、狗的同源性较高,与人类和鸡的同源性较低。对于小分子蛋白质和多肽,有义突变和无义突变对...
关键词：
合作猪 IFN-γ 克隆 序列分析
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
陈立祥 张学文 肖调义 汪冬庚 符少辉 苏建明 陈开健 章怀云
为提高草鱼对出血病的抗性 ,采用显微注射法 ,将克隆在鲤 β-肌动蛋白基因启动子下游的人 α-干扰素基因转移到草鱼受精卵中 ,获得了大量转基因个体 .抽取转基因鱼血浆 ,以酶联免疫吸附法检测了转基因草鱼中人α-干扰素基因的表达情况 .从 6 72尾转基因草鱼中检测出 15 8尾有 α-干扰素的表达 ,阳性率为 2 3.5 1% ,其中表达水平最高个体血浆中α-干扰素质量浓度为 145 0 pg/ m L .基因表达量随季节和个体发育时期有所变化
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
张立娜 刘培欣 曹殿军 闫丽辉 贾竞波 危艳武
以含有全长猪γ干扰素基因的质粒为模板,通过PCR方法扩增猪γ干扰素并引入酶切位点,酶切后与PCI真核表达载体连接在一起,测序后经比较,所扩增序列同Genebank报道的IFN-γ序列同源性为99·8%.将重组质粒转染PK细胞,检测所转染的pIFN-γ的抗病毒活性.试验结果表明,转染pIFN-γ试验组与正常细胞接毒对照组比较有显著差异,说明所构建的重组质粒转染后具有抗病毒作用.
关键词：
猪γ干扰素 真核表达 活性测定
[期刊] 西南农业学报
[作者]
董建宝 谢芝勋 孙建华 刘加波 庞耀珊 邓显文 谢志勤 谢丽基
设计1对特异性引物,采用PCR方法从pMD18-TCHIFN-γ重组载体中扩增得到广西三黄鸡γ-干扰素基因,然后将该基因克隆入含有绿色荧光报告基团EGFP的真核表达载体pEGFP-N1中,构建成pEGFP-N1CHIFN-γ重组质粒,PCR鉴定结果和测序结果均显示,γ-干扰素基因正确地插入到真核表达载体中。使用脂质体转染法将pEGFP-N1CHIFN-γ转染Vero细胞,荧光显微镜下成功地观察到绿色荧光,说明γ-干扰素基因成功表达。
关键词：
鸡γ-干扰素 绿色荧光 真核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘超 康国章 郭天财 岳彩风 沈丙权
采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的发育籽粒中克隆出小麦淀粉合成关键酶—AGPase质体型大亚基(AGPase plastidial large subunit,LSU Ⅱ)cDNA一段特异保守序列,长度为535 bp(GenBank No.EF378944),与DQ409820(小麦)、U66876(大麦)、AK069296(水稻)和DQ406819(玉米)分别有98%,97%,88%,88%的同源性,表明克隆出了小麦LSU Ⅱ基因的部分cDNA序列。以pWM101质粒表达载体为基础,将LSU Ⅱ反向置于pWM101质粒的CaMV35S启动子之后,构建了LSU Ⅱ的反义表达载体pWM10...
关键词：
小麦 AGPase LSU Ⅱ 表达载体
[期刊] 华北农学报
[作者]
陈红英 崔保安 李新生 胡功政 赵丽 王东方
根据GenBank发表的鸭γ-干扰素cDNA基因序列,自行设计、合成1对引物,应用RT-PCR技术,无需用非特异性免疫原如ConA、PHA等刺激分离的脾淋巴细胞,直接提取总RNA,扩增固始鸭γ-干扰素基因(DuIFN-γ),并进行克隆和测序。测序结果表明,获得了DuIFN-γ全序列,其大小为515 bp,包含一个完整阅读框,编码164个氨基酸残基,推导的氨基酸有3个潜在的N-糖基化位点,有5个与二硫键形成有关的半胱氨酸。序列比较分析发现,克隆的固始鸭IFN-γ基因序列与GenBank中4条鸭IFN-γ基因序列中的3条序列(AF087134,AF100929,AJ012254)完全一致,而与另一...
关键词：
固始鸭 IFN-γ基因 克隆 进化分析
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
马艳 朱馨蕾 杨长庚 张富春 尹伟伦
为深入研究胡杨的抗盐分子机制,并获得与之相关的抗逆基因,采用SMART技术构建了胡杨盐胁迫处理cDNA文库。经随机测序,得到一个编号为SSL061的EST序列,与欧美杨的脱水素基因有较高相似性,通过PCR快速扩增文库的方法获得了胡杨脱水素基因(Pedhn)。分析表明,该cDNA的长度为813 bp,拥有681 bp的开放读码框,共编码227个氨基酸。该序列包括两个重复的富含赖氨酸的K片段和由7个连续的丝氨酸残基组成的S片段,但是缺乏Y片段。RT-PCR结果表明,胡杨在未受胁迫的情况下脱水素基因的转录水平较低,而随着盐胁迫浓度的升高,脱水素基因的转录水平总体呈上升趋势。
关键词：
胡杨 cDNA文库 脱水素 盐胁迫
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