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[期刊] 西南农业学报
[作者]
李彬 杜露平 何孔旺 孙冰 倪艳秀 温立斌 张雪寒
为提高猪Hokovirus(PHoV)检测的敏感性和简便性,本研究采用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立了一种敏感、特异、快速、简便、实用的检测PHoV的技术。针对PHoV VP1/2基因保守区设计4条引物,进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化并检测其敏感性和特异性。结果表明,所建立的方法最佳反应时间为60 min,反应温度为65℃,该方法具有良好的特异性,与其它常见动物病毒(PRRSV、PCV2、CSFV、PRV、PPV、JEV)无交叉反应,对PHoV的最低检出量为10拷贝,其敏感性是PCR方法的10倍,且通过加入荧光染料可直接判定结果。研究表明,该方法特异性强、敏感性高,且操作简便、检测...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
车勇良 陈如敬 王隆柏 江斌 吴学敏 刘玉涛 严山 庄向生 周伦江
【目的】建立一种可快速检测副猪嗜血杆菌的环介导等温扩增(LAMP)方法。【方法】根据GenBank中副猪嗜血杆菌肽聚糖相关脂蛋白(PalA)基因序列,在其保守区域设计外引物、内引物和环引物用于LAMP检测。优化副猪嗜血杆菌LAMP检测的反应体系,在反应产物中加入SYBR GreenⅠ,对检测结果进行肉眼判定,建立副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法,评价该检测方法的特异性、敏感性。用建立的副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法对临床分离的8株不同血清型副猪嗜血杆菌进行检测。从疑似患副猪嗜血杆菌病的猪体内采集10种体液,用所建立的可视化LAMP检测方法进行检测。【结果】建立了副猪嗜血杆菌可视化LAMP...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘业兵 张磊 宁宜宝 王琴 范学政
【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪细小病毒(PPV)环介导等温扩增(LAMP)方法,为诊断猪细小病毒提供准确可靠工具。【方法】根据GenBank公布的PPV序列,在其保守序列区域设计了多套LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测反应进程并筛选最佳引物、反应条件,建立了对PPV病毒DNA进行特异扩增的LAMP检测方法,并可通过加入SYBR Green I肉眼判断结果。【结果】该方法在63℃恒温下作用45min,PPV病毒DNA获得了高效率的特异性扩增;其检出限量为0.23TCID50,敏感性高;在反应结束后加入SYBR Green I肉眼...
关键词：
猪细小病毒 LAMP 检测方法
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
祁钊 余相宇 陈魏圆 宋祥军
【目的】利用PfAgo蛋白结合环介导等温扩增技术（LAMP）建立一种新的PCV3检测方法 LAMP-PfAgo法,用于PCV3的快速鉴别诊断。【方法】PCR扩增PCV3 Rep基因,构建重组阳性质粒pMD19-T-PCV3-Rep,对其进行PCR和测序鉴定。根据PCV3 Rep基因的保守区域设计PCV3-T1～PCV3-T4等4组引物（每组包括1对内引物和1对外引物）,以pMD19-T-PCV3-Rep为模板进行LAMP,筛选最佳引物组,并对LAMP反应的Mg2+浓度、内外引物浓度、反应温度、反应时间进行优化。根据PCV3 Rep基因的保守序列,设计PCV3-gs1～PCV3-gs5等5组gDNAs和一条特异性探针,进行LAMP-PfAgo反应,筛选最佳的gDNAs,并对LAMP-PfAgo反应体系中PfAgo蛋白浓度、 gDNAs浓度、Mn2+浓度和反应时间进行优化。对该LAMP-PfAgo方法的特异性、敏感性进行评价;并用该方法和实时荧光定量PCR方法对疑似感染PCV3的46份临床样品进行检测,比较结果的一致性。【结果】重组阳性质粒pMD19-T-PCV3-Rep PCR和测序均获得了891 bp的序列,表明重组阳性质粒构建成功。LAMP最佳引物为PCV3-T1,最佳Mg2+终浓度为6 mmol/L,最佳内外引物终浓度分别为1.6和1.2μmol/L,最适的反应温度65℃,最佳反应时间60 min。使用优化后的LAMP反应条件对PCV3 Rep基因保守序列进行扩增,并将其用于后续试验。LAMP-PfAgo反应最佳的gDNAs为PCV3-gs1;优化后的PfAgo蛋白终浓度为40 U/μL,gDNAs终浓度为1.50μmol/L,Mn2+终浓度为1.50 mmol/L,反应时间为30 min。LAMP-PfAgo法的灵敏度为10拷贝/μL,且与猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒及猪伪狂犬病毒等常见猪源病原核酸无交叉反应。临床样本检测结果显示,LAMP-PfAgo法与实时荧光定量PCR方法检测结果的符合率为100%。【结论】基于PfAgo蛋白结合LAMP技术建立了对PCV3的核酸检测方法,该方法灵敏度高和特异性强,具有潜在的临床应用价值。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
鑫婷 侯绍华 贾红 郭晓宇 丁家波 李延鹏 丁敏 朱鸿飞
【目的】建立一种适用于猪繁殖与呼吸综合症病毒的快速、灵敏、特异性检测方法,即一步反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)。【方法】设计3对针对PRRSVN基因的8个位点的特异性引物,用优化后的反应体系检测RT-LAMP的特异性、灵敏性并对临床样本进行检测。【结果】RT-LAMP检测方法从核酸抽提到检测仅需要70min,肉眼即可观察检测结果,该方法具有良好的特异性,灵敏度是RT-PCR的10000倍,在对50份猪血液样本RNA的检测中,该方法与传统的RT-PCR检测方法具有很好的统一性(κ=0.83)。【结论】RT-LAMP检测方法可快速、灵敏、特异的检测PRRSV,并适用基层和现场检测。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
曹胜波 陈焕春 肖少波 何启盖 徐引弟 刘军发
根据国外已发表的猪环状病毒 2型 (PCV 2 )的全基因组序列 ,设计一对 2型特异性引物 ,对可疑病料进行PCR扩增。将扩增产物连接到pMD 18 T载体上并克隆到大肠杆菌DH5α中 ,经提取质粒进行PCR、酶切、测序鉴定 ,证明扩增出了PCV 2的目的片段。将测序结果与GenBank收录的PCV 2序列进行比较 ,发现同源性均在90 %以上。用该PCR方法在 43份可疑病料中检测到了 12份PCV 2阳性病料 ,表明该病在我国已有流行
关键词：
猪环状病毒2型 检测方法 聚合酶链反应
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘永夏 刘建柱 成子强 周栋 王振勇 刘海涛 王林 柴同杰
【目的】针对猪附红细胞体g1基因编码的MSG1表面粘附蛋白(rMSG1)和以此蛋白制备的多克隆抗体,建立相应的ELISA方法进行猪附红细胞体的临床检测,并进行效果评估,以获得一种猪附红细胞体感染的有效检测手段。【方法】将MSG1-pET28c_E.coli BL21菌株,在适宜的条件进行诱导表达,经菌体破碎、层析等步骤获取纯化的目的蛋白。以纯化的rMSG1制备免疫原接种小鼠,获取符合要求的多克隆抗体。以rMSG1和多克隆抗体建立ELISA检测方法,分析其敏感性、特异性、符合性和重复性。【结果】接种后获得了符合效价的抗血清;基于rMSG1的间接ELISA方法临床检测猪附红细胞体感染率为46.25...
关键词：
猪附红细胞体 MSG1 ELISA 建立
[期刊] 华北农学报
[作者]
路斌 王一成 吴润 袁秀芳 徐丽华 李军星 王朝文
通过对Genbank登录的CSFV、PRRSV和JEV的核苷酸序列进行比对分析,找出CSFV的E2基因,PRRSV的Nsp2基因和JEV的E基因为相对保守区域[1]。利用生物学软件在保守序列分别设计一对引物,通过对PCR反应条件的优化,确定了最佳引物浓度、最佳Mg2+浓度和最佳退火温度,建立了多重二温式PCR方法检测CSFV、PRRSV和JEV。其扩增的目的片断大小分别为CSFV(482 bp)、PRRSV(576 bp)和JEV(375 bp),将传统三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,从而大大节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对CSFV、PRRSV及JEV三种猪主要RNA病毒...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
姜海军 陈琼 孔繁德 李国平 黄印尧 徐淑菲
参照GenBank收录的猪圆环病毒2型(PCV2)基因组全序列选择保守区域设计合成了引物及其探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqM an荧光定量PCR检测方法.用建立的检测方法对临床采集的组织病料进行了检测,并与常规PCR检测方法作比较.结果显示,所建立的方法灵敏度可达3×101拷贝.μL-1,比常规PCR检测方法灵敏度高10倍,而与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)没有交叉反应,具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点,适合于PCV2的流行病学调查和临床诊断.
[期刊] 华北农学报
[作者]
宏春慧 杨兵 覃湘婕 周宏专 徐福洲 苏霞 薛静 张晓东 王金洛
为鉴别猪博卡病毒１型、２型和３型３种基因型，根据猪博卡病毒基因序列分别设计３对针对保守区域的引物进行ＰＣＲ扩增，扩增目的片段大小分别为６４５ ｂＰ（ＰｂｏＶ１型）、３５２ ｂＰ（ＰｂｏＶ２型）和２５９ ｂＰ（ＰｂｏＶ３型）。通过引物浓度和退火温度等条件优化，首次建立了同时检测猪博卡病毒３种基因型的三重ＰＣＲ方法。所建立的三重ＰＣＲ方法扩增其他猪病病毒结果均为阴性，最低检测限为８×１０－７ｎｇ／μＬ。结果表明，该方法具有较好的特异性和敏感性。对临床样品进行三重ＰＣＲ和单项ＰＣＲ检测，对比结果显示符合率为１００％。该方法的建立为猪博卡病毒３种不同基因型的鉴别检测提供了有效手段。
关键词：
猪博卡病毒 基因型 三重PCR 检测
[期刊] 华北农学报
[作者]
张昆丽 林本夫 席振军 杨冬霞 卞志标 宋帅 蒋智勇 蔡汝健 李春玲
为了建立一种高效、灵敏的猪链球菌(SS)检测方法,针对SS的谷氨酸脱氢酶基因(gdh)合成特异性引物,通过优化退火温度与引物浓度,经特异性、敏感性、重复性以及临床样品检测,建立了SS的纳米PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法仅能从SS的基因组序列中扩增得到687 bp的特异性序列,与猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌无交叉反应,且能同时识别1、2、7和9型4个目前流行的SS主要血清型,满足临床上多血清型SS感染检测的需要;敏感性试验结果显示,该方法对SS的最低检测下限为10 cfu/mL,与普通PCR方法相比,灵敏度提高了100倍;重复性试验表明,该方法检测效果稳定,重复性较好。用该方法和普通PCR对临床上收集的44份疑似SS感染样品进行检测,阳性率分别为72.7%(32/44),54.5%(24/44),表明该纳米PCR方法具有灵敏度高,特异性好等优点。综上,本研究建立的SS纳米PCR检测方法,能够准确、高效检测SS,为猪链球菌病的临床诊断和流行病学调查提供了技术支持。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张小敏 周斌 何丹妮 庞然 赵津 陈溥言
根据GenBank中的猪源抗病毒蛋白Mx1基因(poMx1)序列设计1对特异性引物,从Mx1基因全长片段中扩增和克隆了特异性的115 bp核苷酸片段。测序鉴定正确后将重组质粒进行定量并10倍倍比稀释作为扩增模板,通过SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,建立Mx1的标准曲线及回归方程。结果显示:该标准曲线的回归方程为Y=-2.986 3 lg X+38.239 3(R2=0.998 5),灵敏度为1×102μL-1;应用该方法对猪瘟兔化弱毒苗接种猪肾细胞(PK-15)后产生的poMx1 mRNA进行定量分析,发现病毒感染细胞4 h后,poMx1的表达量最高(P<0.01),然后随着时间...
关键词：
猪源Mx1 实时荧光定量PCR 标准曲线
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
高艳 张定全 杨增岐 梁留存 刘海金 吴朋朋 高小龙 常旭东 杜恩岐
【目的】建立快速检测副猪嗜血杆菌抗体的平板凝集试验方法,以便能够对副猪嗜血杆菌病进行快速、准确的诊断。【方法】利用9株(Ea、Ec、Ew、A1、A2、B1、B2、C1、C2)副猪嗜血杆菌陕西分离株制备平板凝集抗原,用其免疫健康家兔制备血清抗体,建立副猪嗜血杆菌平板凝集检测方法,对制备抗原的优势菌株进行筛选,并对该方法的特异性、敏感性、抗原最佳工作浓度进行检测。【结果】选出Ew株作为制备抗原的种子菌株,成功建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的平板凝集试验方法;该方法具有良好的特异性和敏感性,抗原最适工作浓度为8×109 CFU/mL。采用本试验建立的副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法对临床血清样品的检测结果与...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张帆帆 宋德平 周信荣 黄冬艳 李安琪 彭棋 陈燕君 吴琼 何后军 唐玉新
【目的】猪Ｄｅｌｔａ冠状病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｄｅｌｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，ＰＤｃｏｖ）是近年来新发现的可引起猪只，特别是新生仔猪腹泻的冠状病毒，其引发的腹泻具有较高的发病率和死亡率，是造成新生仔猪死亡的重要原因之一。试验拟建立新现ＰＤｃｏｖ ｒｔ－Ｐｃｒ检测方法，并调查当前江西腹泻猪群中ＰＤｃｏｖ的感染情况。【方法】通过对Ｇｅｎ Ｂａｎｋ数据库中ＰＤｃｏｖ全基因组序列的比对分析，找出保守序列，用Ｐｒｉｍｅｒ ３．０在线软件设计１对扩增ＰＤｃｏｖ核衣壳（ｎ）蛋白基因片段的特异性引物，基于该引物建立ＰＤｃｏｖ ｒｔ－Ｐｃｒ检测方法；用建立的方法检测腹泻猪粪便及肠道样品，挑选阳性扩增产物进行克．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
宋帅 李春玲 臧莹安 郭海祥 李淼 杨冬霞 徐志宏
为了建立一种准确、快速的副猪嗜血杆菌病原夹心ＥＬＩＳＡ检测方法，以副猪嗜血杆菌外膜蛋白Ｐ５的特异性单克隆抗体１Ｅ２作为捕获抗体，兔抗副猪嗜血杆菌多克隆抗体作为检测抗体，通过方阵滴定优化夹心ＥＬＩＳＡ检测方法最佳反应条件，并对该检测方法进行特异性、敏感性验证以及临床样品的检测应用。结果显示，该检测方法中单克隆抗体１Ｅ２最佳包被浓度为３．４３４μｇ／ｍ Ｌ，兔抗副猪嗜血杆菌多抗的最佳稀释浓度为３．３５０μｇ／ｍ Ｌ，用１０ ｍｇ／ｍ Ｌ明胶３７℃封闭１ ｈ优于其他封闭液，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多体最佳使用浓度为１∶４ ０００。该检测方法的特异性试验结果显示可检测出１５个血清型的副猪嗜血杆菌病．．．
关键词：
副猪嗜血杆菌 单克隆抗体 夹心ELISA
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