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[期刊] 华北农学报
[作者]
谢立兰 安康 陈力 孙紫德 方六荣
DEAD-box解旋酶21(DEx D-box helicase 21,DDX21)是含DEAD-box的RNA解旋酶家族成员之一,不仅参与RNA的合成和加工过程,同时还参与机体的天然免疫应答,调控病毒的复制。为了研究猪DDX21基因的结构和功能,以猪肾传代细胞(PK-15)总cDNA为模板,根据GenBank公布的预测序列(XM_005657387.2)设计引物扩增猪源DDX21基因,并采用分子生物学软件将其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果显示,首次成功克隆了猪DDX21基因的cDNA序列(Ge
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
王丽华 李杰勤 詹秋文 樊飞飞
以高粱品系早亨加利为材料,通过RT–PCR扩增,克隆高粱Sb CAD4基因。测序结果表明,克隆的Sb CAD4基因与NCBI基因库中高粱IS11861品系只在编码序列第548位有1个碱基的差异,而二者的氨基酸序列完全一致。进化树分析结果表明,Sb CAD4与拟南介、水稻、玉米的木质素合成CAD基因位于同/L1个群中。比对分析结果表明,Sb CAD4与木质素合成基因具有相同的结构域。将构建正确的重组质粒(p MAL–Sb CAD4)转化入大肠杆菌菌种BL21中进行诱导表达的结果表明,IPTG的最佳诱导浓度为0.5 mmol/L。经Amylose Resin亲和层析柱纯化后,Sb CAD4融合蛋白...
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘萍 马晓霞 周小凯 马鹏 常秋燕 李林杰 李凌浩 马忠仁
为了研究流产衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)的免疫原性,建立快速有效的流产衣原体抗体检测方法,根据Gen Bank中公布的流产衣原体基因组序列,设计并合成了流产衣原体CPAF蛋白编码基因的特异性引物,以流产衣原体标准菌株基因组为模板,经PCR扩增获得长度为1 809 bp目的基因片段;对获得的目的基因进行测序,并用生物信息学软件进行预测分析;再将该片段插入原核表达载体p ET-30a中,经双酶切、测序鉴定;构建成功的表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG对目的蛋白进行诱导表达,通过对诱导条件的优化,确定诱导表达的最佳条件,表达产物用SDS-PAGE和Western Blot检测。结果显示,成功克隆流产衣原体CPAF蛋白的编码基因,该编码产物可能是定位于宿主细胞质中的一种衣原体分泌性蛋白酶,分子内具有多个可能的抗原表位;重组表达质粒经IPTG诱导后,表达分子质量为67.6 ku的CPAF蛋白,该重组蛋白能与抗His-tag单克隆抗体以及流产衣原体阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。结果表明,以大肠杆菌表达系统重组表达的流产衣原体CPAF蛋白具有良好的免疫原性,可作为动物流产衣原体病的血清学诊断及亚单位疫苗研究的候选抗原。
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘裕峰 朱天辉 刘应高 谯天敏 李姝江 龙旭梅 韩珊
为深入研究板栗WRKY转录因子基因在板栗抗病过程中的分子作用机制,根据板栗转录组数据库分析获得EST序列,利用RT-PCR技术,克隆板栗WRKY转录因子cDNA(CmWRKY)序列,分析CmWRKY基因及其编码蛋白的相关信息并进行原核表达研究。结果表明,CmWRKY基因为1 437 bp,编码479个氨基酸,推测蛋白分子质量为52. 128 96 ku,理论等电点为9. 15,具有2个WRKY保守结构域和2个C2H_2锌指结构域,属于WRKY家族的第Ⅰ组,基因登录号为KY312850. 1。CmWRKY核苷酸序列与巴旦木等植物的WRKY基因一致性均在80%以上,与西班牙栓皮栎WRKY基因一致性最高,达到97%。同源建模表明,CmWRKY蛋白三级结构与拟南芥At WRKY1蛋白结构相似,推测其可能与At WRKY1具有相似的调控功能。分子进化分析显示,板栗CmWRKY与西班牙栓皮栎及核桃WRKY蛋白亲缘关系最近。SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,CmWRKY蛋白最佳诱导表达条件为0. 2 mmol/L IPTG在30℃下诱导10 h,蛋白分子质量为56 ku,其主要以可溶性蛋白的形式存在。为板栗CmWRKY基因的生物学功能研究及应用奠定基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
吴玉丹 王文兵 李兵 王东 沈卫德
【目的】获得家蚕溶茧酶基因的全长序列,实现溶茧酶基因在大肠杆菌中的融合表达。【方法】利用cDNA末端扩增技术(RLM-RACE)克隆了家蚕溶茧酶基因cDNA序列(GenBank登录号:EF428980)。【结果】家蚕溶茧酶基因cDNA序列全长1047bp,其中780bp的蛋白质编码区可编码260个氨基酸,预测蛋白质分子量为27.6kD,等电点(pI)为8.89。家蚕溶茧酶基因包含4个内含子。用Signal P3.0Server程序分析家蚕溶茧酶基因,预测其从第1～22位为信号肽序列。SMART分析结果预测其第34～254位氨基酸序列具有类胰蛋白的丝氨酸蛋白酶活性。重组质粒pET-32a-Coc...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
陈婷婷 孙庚 刘金亮 孙明洋 胡瑞学 张世宏 潘洪玉
核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)有性生殖决定着菌核病的初侵染及流行程度,有性生殖过程中的交配型基因对该菌的性别控制和遗传进化起着决定性作用,为揭示核盘菌有性生殖的分子机制,本研究对核盘菌的交配型基因MAT-2进行了克隆、序列分析及其原核表达的研究。根据GenBank中核盘菌MAT-2基因(DQ159959)序列设计引物,提取该菌总RNA,采用Reverse Transcription-PCR(RT-PCR)的方法扩增交配型基因MAT-2,对其进行序列分析,构建其原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21中进行原核表达。以反转录产物为模板,扩增出1...
[期刊] 华北农学报
[作者]
张元臣 胡梦杰 薛爽 郭文军 沈红 王景顺
利用反转录PCR(RT-PCR)和末端快速扩增(RACE)技术从三龄黏虫体内获得新型抗菌肽Diapausin基因的全长序列，利用生物信息学软件对该序列进行分析，并用原核表达体系对其进行诱导表达，为探究该基因的结构和功能提供理论参考。结果表明，成功克隆到了黏虫新型抗菌肽Diapausin基因，命名为Mysdiap(GenBank登录号：AZJ51075)。该基因全长537 bp,其中5′端和3′端非编码区分别为63,279 bp,开放阅读框全长195 bp,编码64个氨基酸残基，预测蛋白质分子质量为7.13 ku,等电点为5.59。Mysdiap的N端前24个氨基酸残基为信号肽序列。多重联配结果表明，Mysdiap氨基酸序列中具有高度保守区域ECCRAHG。成功构建了pET-Mysdiap重组表达质粒，并在大肠杆菌中用IPTG诱导其表达，表达的重组蛋白分子质量在20 ku左右，以包涵体和可溶性蛋白形式存在。综上，从黏虫中克隆获得了新型抗菌肽基因Mysdiap的全长序列，并在大肠杆菌中成功诱导其表达。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
徐齐君 扎桑 王玉林 原红军 曾兴权 尼玛扎西
【目的】克隆青稞核糖体蛋白基因HbRPL19,分析其序列特征并在大肠杆菌中诱导目的蛋白,为后续的研究奠定基础。【方法】根据鉴定得到的青稞HbRPL19的序列设计了引物,从青稞叶片的c DNA中扩增得到目的片段,并对目的基因序列进行了测序鉴定和序列分析,同时构建了原核表达载体p ET28a-RPL19,转化入大肠杆菌BL21(DE3)后利用IPTG诱导外源蛋白质表达并检测。【结果】成功扩增出了青稞核糖体蛋白基因HbRPL19的CDS全长序列,大小为654 bp。根据生物信息学分析的结果,HbRPL19编码的蛋白质含有217个氨基酸,相对分子质量为24.47 KD,理论等电点(p I)为10.42,总平均亲水性(GRAVY)为-0.353,不稳定系数为53.46,存在典型的SH3-like结构域和核糖体蛋白L19结构域。系统进化分析表明,HbRPL19与小麦和山羊草的RPL19具有较近的亲缘关系。蛋白表达结果显示,重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。【结论】获得了青稞抗寒相关基因HbRPL19的序列和蛋白。
[期刊] 海洋渔业
[作者]
李英英 陈曦 杨金先 陈强 宋铁英 葛均青
为了研究欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）RIG-I基因的特性，本实验通过设计引物，扩增其序列，克隆至pCE2-TA/Blunt-Zero载体，测序验证后对所获得欧洲鳗鲡RIG-I基因序列进行生物信息学分析及原核表达。结果表明，欧洲鳗鲡RIG-I基因ORF序列有2 823 bp碱基，编码940个氨基酸，与日本鳗鲡（A. japonica）的序列同源性为96.71%；RIG-I蛋白属酸性亲水性蛋白，不存在跨膜结构，无信号肽，较不稳定，主要分布于细胞质中，有6个保守功能区；SDS-PAGE和western blot结果显示，实现了RIG-I基因在大肠杆菌中的高效表达，为后期制备RIG-I多克隆抗体，进一步探索RIG-I介导的天然免疫在鳗鲡抵御鳗鲡疱疹病毒（Anguillid herpesvirus， AngHV）侵染过程中的作用机制提供研究基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王延玲 张艳敏 冯守千 田长平 王海波 刘遵春 宋杨 陈学森
【目的】克隆新疆红肉苹果[Malus sieversii f.neidzwetzkyana(Dieck)Langenf]MYB10转录因子基因,进行序列分析和原核表达研究,为进一步探索红色发育机理及选育新的栽培红肉苹果奠定理论基础。【方法】根据MdMYB10基因编码区设计1对特异引物,以新疆红肉苹果叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得1个约700bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该基因片段连接到原核表达载体pET-30a(+)中,构建融合表达质粒,转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长包含...
[期刊] 华北农学报
[作者]
于翠梅 张志宏 刘月学 马跃 李贺 代红艳
克隆草莓轻型黄边病毒CP基因,并构建其原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达CP蛋白。利用SMYEV的检测引物,通过RT-PCR技术筛选带SMYEV的草莓植株;根据NCBI中SMYEV序列设计扩增CP基因全长引物,通过RT-PCR获得SMYEV沈阳分离物CP基因全长序列;将CP基因克隆到原核表达pGEX-6P-1上,利用IPTG诱导CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达蛋白。利用RT-PCR扩增获得SMYEV分离物SY05的CP基因全长序列,由729个核苷酸组成,编码242个氨基酸残基。SY05与其他SMYEV分离物的核苷酸同源性为80.1%～97.4%,氨基酸同源性为92.1%～99.6%,...
关键词：
草莓轻型黄边病毒 外壳蛋白基因 原核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
韩磊 迟胜起 张剑峰
为制备番茄褪绿病毒（ＴｏｍａＴｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ，Ｔｏ ｃｖ）抗血清，以番茄病叶为试验材料，提取总ｒＮａ，根据Ｔｏ ｃｖ ｃＰ基因设计特异性引物，利用ｒＴ－Ｐｃｒ方法克隆目的基因，构建原核表达载体Ｐ ＥＴ３２ａ－Ｔｏ ｃｖｃＰ，在大肠杆菌ｒｏｓＥＴＴａ（ＤＥ３）菌株中表达ｃＰ蛋白。结果表明：Ｔｏ ｃｖ ｃＰ基因（ＧＥＮ ＢａＮｋ登录号：ｋＴ８０９４００）全长７７４ ＢＰ，编码２５７个氨基酸，与ＧＥＮ ＢａＮｋ中其他地区分离物核苷酸序列同源性为９７．２％～９９．６％，推导的氨基酸序列同源性为９７．３％～１００．０％。核苷酸序列保守位点占全部位点的９１．３％，氨基酸序列保守位点占全．．．
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
林艺远 刘国平 吴斌 赵战勤 陈焕春
以湖北本地分离的致猪水肿病大肠杆菌鄂E株为模板,PCR扩增去掉信号肽和跨膜区的SLT-IIeB基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-KG。同时对筛选出的阳性质粒pGEX-SLT-IIeB进行测序,测序结果与Genbank上发表的12个SLT-IIeB基因序列的同源性达100%,表明该基因保守性很好。重组质粒pGEX-SLT-IIeB经IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了表达,SDS-PAGE分析表明表达产物GST-SLT-IIeB有特异性表达带,Western-blot检测证实表达产物具有免疫反应性。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
徐永杰 郭英 王延博 金芳芳 刘邓英 梁小娟 宋新强 陈世锋 熊远著 马云
基于2-DE和MS的蛋白质组学方法分析梅山猪骨骼肌发育过程中蛋白质动态表达变化,发现CCT5差异表达。为进一步获得猪CCT5基因的序列特征、时空表达及生物学功能等相关信息,克隆猪CCT5基因,分析不同物种序列进化关系,检测CCT5在猪不同组织和骨骼肌不同发育阶段中的表达。序列分析结果表明:在获得的2 286 bp猪CCT5 cDNA序列中包括1 626 bp的完整开放阅读框(ORF),编码541个氨基酸,其氨基酸序列与人的相似性为97%,表明该蛋白在不同物种间高度保守。荧光定量PCR结果显示,CCT5基因在猪肌肉和脂肪中表达量最高,心、肝等组织中表达量很低,没有肌纤维特异性;不同发育阶段骨骼肌...
关键词：
猪 CCT5 骨骼肌 克隆 表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
姜维 薛鹏 何永新 陈玉林
【目的】克隆山羊Eda基因CDS区全序列,并对其进行序列分析,研究Eda基因在毛囊生长周期不同阶段皮肤组织中的表达规律。【方法】以太行黑山羊为研究对象,采集其毛囊生长休止期、生长期和退行期背部皮肤组织,采用RT-PCR技术克隆山羊Eda基因,通过在线软件Blastn进行基因cDNA序列分析,用SMART进行氨基酸序列分析,利用SWISS-MODEL软件进行蛋白质结构分析;以β-actin为看家基因,采用实时荧光定量PCR技术对Eda mRNA在毛囊生长不同时期皮肤组织中的表达规律进行分析。【结果】太行黑山羊Eda-A1基因CDS区全长1 176bp,编码391个氨基酸;Eda-A2比Eda-A...
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