[目的]本文旨在扩增猪CYP11A1基因编码区，鉴定并分析其核心启动子区，探究猪CYP11A1基因的转录调控机制。[方法]通过基因克隆测序技术获得猪CYP11A1基因编码区全序列，并对其序列特征进行分析；利用荧光素酶活性试验鉴定猪CYP11A1基因核心启动子区，并通过生物信息学分析猪CYP11A1基因核心启动子区上潜在的甲基化位点与转录因子结合位点；同时，利用Western blot、qRT-PCR以及染色质免疫沉淀（ChIP）等分子生物学手段解析转录因子NR2C1对猪CYP11A1基因的转录调控功能。[结果]猪CYP11A1基因的编码区序列全长为1 563 bp，在哺乳动物的进化过程中高度保守；猪CYP11A1基因的核心启动子区为-398 bp～-108 bp（转录起始位点为+1），序列特征分析发现猪CYP11A1基因核心启动子区上包含多个潜在的转录因子的结合元件，包括NR2C1、SOX10、NFIX和ELF5等；另外，转录因子NR2C1可促进猪CYP11A1基因核心启动子区活性，同时显著上调体外培养的猪卵巢颗粒细胞中CYP11A1基因的表达。[结论]哺乳动物CYP11A1基因在进化过程中高度保守，NR2C1作为转录因子能够促进猪卵巢颗粒细胞中CYP11A1基因的转录。

通过双荧光素酶报告基因载体系统检测猪抗酶１（ＡＺ１）基因启动子转录活性，分析蓝塘和长白猪群体ＡＺ１基因启动子ＳＮＰ及单倍型，在此基础上比较不同单倍型转录活性。结果表明：－４５３／＋７９为核心启动子区；在２个群体中检测到ＡＺ１基因启动子８个ＳＮＰＳ，分别为－７１３ Ｔ＞Ｃ、－５８４ Ａ＞Ｃ、－４７６ Ｇ＞Ａ、－３６５ Ｔ＞Ｃ、－３４８ Ｃ＞Ｔ、－２９４ Ｇ＞Ｃ、－２８８ Ｔ＞Ｇ和－２３４ Ｔ＞Ｃ，蓝塘猪群体具有更丰富的单核苷酸多态性，而长白猪群体仅在－２８８座位存在ＧＧ和ＧＴ ２种基因型，其他７个ＳＮＰＳ均为纯合状态；蓝塘猪群体ＬＴＨ１单倍型（ＴＡＧＣＣＧＴＣ，－７１３／－２３４）频率为０．５２．．．

ATP6V0A4基因编码V-ATP酶的一个亚基,与H~+转运相关,是遗传性远端肾小管性酸中毒的致病基因。在前期研究中发现,民猪在遭受冷应激后其背脂中ATP6V0A4基因的转录水平发生了显著上升(P

【目的】获得猪POU1F1基因启动子区的多态信息,揭示其在不同品种中的分布特点,阐明其与生长性状的关联性。【方法】采用PCR克隆、DNA测序和PCR-RFLP技术进行POU1F1基因启动子区多态分析,利用一般线形模型分析其与生长性状的关联性。【结果】在POU1F1基因1.5 kb的启动子区域内发现5个多态位点;其中,5 bp短片段插入或缺失突变的A等位基因频率在引入品种猪中最高,在培育品种中中等,在中国地方品种最低。一般线形模型分析表明,该多态位点与猪的生长性状存在显著相关。多重比较分析发现,AA基因型个体的体高、体长、胸围和体重显著高于AB和BB基因型个体(P<0.05),而AB和BB基因型...

【目的】构建美洲棉铃虫细胞色素P450基因CYP321 A1启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体,为探索CYP321 A1基因的转录调控机制奠定基础。【方法】设计合成PCR引物,从美洲棉铃虫基因组DNA中扩增并克隆CYP321 A1基因的启动子区;将克隆的启动子片段插入载体pGL3-basic构建萤火虫荧光素酶报告基因载体p(-1 470/+64);用p(-1 470/+64)转染美洲棉铃虫脂肪体细胞系BCIRL-HzFB33,并用双荧光素酶报告基因检测系统分析该启动子活性。【结果】p(-1 470/+64)经双酶切、PCR鉴定及DNA测序分析鉴定准确无误;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,证实所...

采用测序和PCR-RFLP的方法,分析了MSTN基因启动子区在7个品种绵羊中的单核苷酸多态性,结果表明:存在2个SNP位点(-959T/C,-784G/A),表现为6种基因型(TT、TC、CC、GG、GA、AA),在-959T/C位点中,国外肉用绵羊品种陶赛特、德国肉用美利奴及我区的巴士拜羊,TT为优势基因型,地方品种绵羊巴音布鲁克羊、多浪羊和阿勒泰羊在该位点中CC为优势基因型,经χ2检验,其群体的基因频率和基因型频率均处于Hardy-Weinberg平衡状态,群体遗传多态性分析表明,这6个绵羊品种中群体的多态信息含量(PIC)均处于0.25～0.50之间,为中度多态,特克赛尔羊在该位点未发生...

【目的】构建以缺失不同功能区的猪内源性反转录病毒(PERV)5′非编码区(5′UTR)为启动子的萤光素酶表达载体,分析5′UTR的转录调控规律。【方法】将含有不同功能域的PERV的UTR克隆至萤光素酶表达载体上,转染瞬时表达细胞Cos-7,检测萤光素酶的表达。【结果】缺失R区的5′UTR显示出很强的启动子活性,U3重复区序列缺失的5′UTR启动子活性显著下降。UTR显示出较之LTR强的启动子活性。缺失整个U3区的UTR比仅缺失U3重复区的UTR启动子活性强。【结论】在R区有转录因子的结合位点可引起转录活性下降;U3重复区序列表现出增强子的活性。在5′UTR的下游序列中,包括引物结合区(PBS)...

以梅山猪-大白猪正反交为模型,以65日龄和100日龄的胚胎心脏组织为研究材料,对MKRN3基因启动子区CpG岛进行预测,根据预测的CpG岛设计引物,采用重亚硫酸盐测序法(BSP法),分析MKRN3基因启动子区CpG岛在胚胎心脏组织的甲基化程度。结果显示:对于65日龄胚胎,猪MKRN3基因启动子区CpG岛在大白×梅山和梅山×大白杂交后代的胚胎心脏组织中均表现高度甲基化(75.6%、76.4%);对于100日龄的胚胎,大白×梅山杂交后代的胚胎心脏组织表现高度甲基化(80%),而梅山×大白杂交后代的胚胎心脏组织呈现低甲基化(35.6%)。由此可见,猪MKRN3基因启动子区CpG岛的甲基化模式随着正反交、胚胎发育时期不同而呈现出一定变化,即在胚胎发育65日龄时,正反交子代均具有高度甲基化;而在胚胎发育至100日龄,正交子代呈现高度甲基化,反交子代呈现低甲基化,说明在胚胎发育晚期父本或母本等位基因可能会发生明显的去甲基化。

为了探究骨骼肌α肌动蛋白1(ACTA1)基因在肌肉和脂肪等6个组织中的甲基化状态及mRNA表达水平,以类乌齐牦牛、麦洼牦牛为研究对象,成功克隆了牦牛ACTA1基因启动子区序列,且采用重亚硫酸氢盐测序法(BSP)检测ACTA1基因启动子区甲基化模式,并通过实时荧光定量PCR检测ACTA1基因在臀大肌、心脏、肾脏、肺脏、肝脏和脂肪组织中的mRNA表达水平。结果显示,牦牛ACTA1基因转录起始位点上游及第一外显子区部分序列总长为1 028 bp;BSP法分析发现肌肉组织DNA甲基化水平最低,脂肪组织甲基化率最高,其中,类乌齐牦牛臀大肌、心脏、肾脏、肺脏、肝脏和脂肪的甲基化概率分别为6.25%,6.88%,20.00%,16.25%,26.25%,29.38%,麦洼牦牛臀大肌、心脏、肾脏、肺脏、肝脏和脂肪的甲基化概率分别为5.00%,7.50%,18.13%,20.00%,26.25%,28.75%;ACTA1基因mRNA表达量在肾脏、肺脏、肝脏和脂肪均极显著低于臀大肌(P<0.01),且显著低于心脏(P<0.05),类乌齐牦牛和麦洼牦牛心脏mRNA表达量具有显著性差异(P<0.05),类乌齐牦牛肺脏组织甲基化率显著低于麦洼牦牛(P0.05),各组织甲基化水平与ACTA1基因mRNA表达量呈极显著负相关(r=-0.797,P=0.002)。结果表明,ACTA1基因DNA甲基化模式对肌肉发育具有一定的调控作用,可为牦牛遗传育种表观遗传标记提供部分数据支持。

【目的】前期研究证实linc-NORFA作为母猪繁殖性状候选基因参与调控卵泡闭锁与卵泡颗粒细胞凋亡过程,进一步鉴定二花脸猪linc-NORFA核心启动子并分析其转录调控机制,为解析linc-NORFA介导猪卵泡闭锁的分子机制奠定理论基础并提供新的研究思路。【方法】采集二花脸猪耳组织样品并提取基因组DNA,利用PCR扩增和测序技术获得二花脸猪linc-NORFA5′调控区序列;通过构建缺失表达荧光报告载体并利用荧光素酶活性试验鉴定二花脸猪linc-NORFA核心启动子;利用生物信息学分析二花脸猪linc-NORFA核心启动子区序列特征与潜在的转录因子结合位点;构建猪FOXO1真核生物表达载体并进一步采用Western blot、qRT-PCR以及荧光素酶活性试验分析转录因子FOXO1过表达对二花脸猪linc-NORFA转录的影响;利用染色质免疫沉淀(ChIP)技术鉴定转录因子FOXO1与二花脸猪linc-NORFA核心启动子区的结合能力。【结果】通过克隆测序与序列拼接共获得二花脸猪linc-NORFA 5′调控区序列1 734 bp,其中包含两个潜在的CpG岛;利用荧光素酶活性试验证实linc-NORFA核心启动子位于-988—-684 bp(转录起始位点作为+1),生物信息学分析表明二花脸猪linc-NORFA核心启动子上包含多个转录因子的结合元件,例如ESR2、FOXO1、E2F1、BRCA1以及NFIC等;另外,ChIP试验还证实在猪卵巢颗粒细胞中FOXO1作为转录因子直接靶向结合在linc-NORFA的核心启动子区;进一步通过试验证实FOXO1过表达可显著下调linc-NORFA核心启动子区活性(P<0.01),同时显著抑制体外培养的猪卵巢颗粒细胞中linc-NORFA的表达(P<0.01)。【结论】鉴定了二花脸猪linc-NORFA核心启动子区,同时证实FOXO1作为转录因子能够与linc-NORFA核心启动子区特异性结合,进而抑制后者的转录活性与表达。研究结果对探究linc-NORFA在猪卵泡闭锁过程中显著下调的分子机制具有重要意义。

旨在对猪SIM1基因的转录调控机制及表达模式进行初步探讨。采用PCR法扩增猪SIM1基因5'端上游的启动子区,应用生物信息学方法对这一区域内潜在的转录因子结合位点进行预测,采用5'端侧翼序列缺失获得8段长度不等的启动子片段,并分别克隆至荧光素酶报告基因表达质粒(p GL3-Enhancer)中,利用双荧光素酶报告活性检测分析SIM1基因启动子区不同长度片段在293T、MGC803和Bel7402细胞中瞬时转染后的活性。同时,采用Western Blot实验检测SIM1蛋白在猪7个不同组织的表达模式。结果表明,各SIM1启动子片段在293T、MGC803和Bel7402细胞中均有活性,在293T...

[目的]为了深入研究香蕉长链非编码RNA Malnc2310的功能和特性，对Malnc2310的启动子顺式作用元件、病原菌响应模式及结合因子进行了初步的研究。[方法]将Malnc2310全长启动子P1(1 625 bp)及从5′端到3′端序列互补的启动子片段P2(400 bp)、P3(800 bp)和P4(425 bp)转入拟南芥，研究其在高盐和尖孢镰刀菌粗毒素胁迫下的响应模式；以Malnc2310启动子P1为诱饵，利用酵母单杂交技术筛选获得与该启动子结合的转录因子，并确定启动子的核心功能区。[结果]Malnc2310的启动子包含多个与光照、病原菌、激素响应相关的顺式作用元件；所有启动子片段在尖孢镰刀菌粗毒素处理的GUS活性比高盐处理后更高，且P3驱动下GUS的活性与全长P1驱动下的活性相似；通过酵母单杂文库筛选到128个潜在的结合因子序列，其中双C2H2结构的锌指蛋白ZFP-WIP2经点对点酵母单杂交验证可与P1和P3互相结合。[结论]Malnc2310的启动子对尖孢镰刀菌粗毒素比对高盐处理更敏感，筛选到1个锌指蛋白ZFP-WIP2可与启动子核心功能区(425～1 225 bp)结合。

脂肪甘油三酯水解酶(ATGL)是脂肪水解过程中的主要限速酶，是调控细胞中甘油三酯和脂肪酸之间平衡的关键因子。为了分析奶山羊ATGL基因启动子的结构及转录调控机制，以奶山羊全血DNA为模板，通过PCR技术扩增出ATGL基因5′侧翼序列并进行生物信息学分析；构建了5个不同长度的启动子缺失片段报告基因载体，通过转染奶山羊乳腺上皮细胞并检测其活性，确定其核心区域；分别用PPARG激动剂罗格列酮和SREBP1激动剂T0901317处理细胞，检测其对ATGL启动子活性的影响。结果表明，克隆得到奶山羊ATGL基因5′侧翼序列2 721 bp,包含转录起始位点上游2 024 bp。经在线软件分析发现，ATGL启动子含有真核生物启动子元件TATA-box和CpG岛；对转录因子结合位点预测发现，其上含有FOXO、SREBF1、PPARG、C/EBPα和E2F1等结合位点。启动子活性分析结果表明，ATGL启动子核心区域位于转录起始位点上游-256—+1位，且在-527—-256位存在负调控元件。用罗格列酮和T0901317处理细胞后发现，二者均能显著上调ATGL启动子活性，且罗格列酮作用的区域为-527—-256位，T0901317在-882—-527位发挥作用，表明PPARG和SREBP1调控ATGL启动子活性。

通过PCR法扩增出陆地棉GhRDL1基因ATG上游1.2 kb的片段,将该片段融合GUS报告基因进行棉花、拟南芥及烟草转化。分析显示,GhRDL1基因启动子是一个棉纤维或表皮毛特异的启动子,能够驱动靶基因在单细胞的表皮毛(如棉纤维和拟南芥表皮毛)表达;在烟草表皮毛中,GUS基因在多细胞的腺毛(包括顶端的腺体细胞和柄细胞)和非腺毛中皆有表达。表明GhRDL1基因启动子是一个多功能的表皮毛特异启动子,可以用于棉花基因工程改良和植物次生代谢工程的研究。

【目的】鉴定牛ＭＹＯＺ１基因转录起始位点，确定牛ＭＹＯＺ１基因核心启动子区域，为进一步研究牛ＭＹＯＺ１基因的转录调控机制奠定基础。【方法】以秦川牛肌肉５′ＲＡＣＥ准备ＣＤＮＡ为模板，设计５′ＲＡＣＥ扩增试验，确定牛ＭＹＯＺ１基因转录起始位点。以秦川牛外周血基因组ＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ克隆获得牛ＭＹＯＺ１基因转录调控区－１ ６２８／＋６１目的片段。通过生物信息学分析软件预测可能包含的转录因子结合位点，设计逐段缺失引物，获得７个亚克隆，将其分别与ＰＧＬ３－ＢＡｓｉＣ载体连接，得到牛ＭＹＯＺ１基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒，通过脂质体法转染Ｃ２Ｃ１２细胞系，检测７个重组质粒的荧光素酶活性，分．．．