【目的】制备猪源CD1d的多克隆抗体，为探究猪CD1d蛋白在非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染过程中的功能奠定基础。【方法】利用PCR方法扩增了猪CD1d基因，并将其同源重组至pGEX-6p1载体中，构建了原核重组表达质粒pGEX-6p1-CD1d。将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)并用IPTG进行诱导表达，表达的GST-CD1d重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot(WB)方法鉴定，SDS-PAGE结果显示约50 ku处有一条明显的条带，该蛋白以包涵体形式表达。然后利用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析方法进行蛋白纯化，将纯化的GST-CD1d蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后，将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔，采用颈背部多点皮下注射，免疫剂量为200μg/只，首免后第3周和第5周分别进行二免和三免，均采用弗氏不完全佐剂乳化，方法和剂量与首免相同。三免后第7天，通过耳缘静脉采血分离血清。首免后第7周进行第四次免疫，一周后心脏采血。该抗体经Protein G亲和层析纯化后冻存于-80℃冰箱。通过WB和间接免疫荧光（IFA）鉴定瞬时转染表达的外源CD1d蛋白和猪原代巨噬细胞（PAMs）表达的内源CD1d蛋白的表达与细胞定位情况。同样，制备的CD1d抗体可以将外源瞬时转染表达的CD1d通过IP拉下。为了探究CD1d在ASFV感染早期的情况，将ASFV接种于PAMs，制备ASFV感染0、15、30、60 min的样品，以CD1d为一抗，通过WB检测了CD1d蛋白的表达情况。在HEK293T细胞共转pCAGGS-HA-CD1d和pCAGGS-Flag-CD2v质粒，24 h后收取细胞裂解，加入Flag beads过夜结合蛋白，通过WB检测互作情况染，同时，质粒共转染于共聚焦小皿中的HEK293T细胞，用标签抗体对其进行孵育，选择相应的荧光二抗，通过激光共聚焦显微镜观察CD1d与CD2v在细胞中共定位情况。采用Co-IP验证CD1d与ASFV外囊膜蛋白CD2v的相互作用。【结果】原核表达的GST-CD1d蛋白以包涵体形式表达在感受态细胞中，分子质量约为35 ku；实验兔4次免疫CD1d重组蛋白后采血并分离血清，纯化的抗体经SDS-PAGE检测在45和25 ku处各出现一条特异性条带，分别为CD1d抗体的重链与轻链。以纯化的CD1d蛋白作为免疫原制备的兔抗CD1d抗体包含重链和轻链，且具有较好纯度；该抗体能够通过WB和IFA鉴定瞬时转染的外源以及PAMs内源CD1d蛋白的表达和细胞定位。进一步检测结果显示，ASFV感染PAMs后，CD1d蛋白表达水平明显增加，并且WB和IFA结果显示CD1d与ASFV编码的外囊膜蛋白CD2v存在相互作用和共定位。【结论】通过原核表达技术制备了CD1d的抗体，为进一步探究CD1d蛋白在ASFV感染过程中的生物学功能打下了基础。

提取睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)基因组DNA,PCR扩增teiR基因,将扩增产物克隆到pET28a中,经酶切验证后获得teiR基因表达载体pET28a-teiR.将重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,添加终浓度为1 mmol.L-1的IPTG进行诱导,提取细菌总蛋白进行蛋白的SDS-PAGE电泳.并根据融合蛋白特性,利用Ni-NTA Spin Column对TeiR融合蛋白进行分离纯化,经分离纯化后的重组蛋白在SDS-PAGE上呈现出单一条带.进一步以获得的TeiR融合蛋白为抗原,制备兔抗TeiR多克隆抗体,经ELISA测定该抗...

根据FAdV-4 NP株F1蛋白编码框的主要抗原位点,设计一对特异性引物,经PCR扩增、测序,分析表达效率后,进行密码子优化;以合成的新序列作为模板,构建重组表达质粒pET-32a-F1,将质粒转化到BL21中,筛选诱导条件,Western blot鉴定表达产物;将待纯化蛋白依次经过不同浓度的咪唑洗脱,纯化重组蛋白;最后将纯化后的蛋白免疫新西兰黄兔,收集血清并用间接ELISA法测定抗体效价.结果表明,所设计的特异性引物扩增了一条约699 bp的片段.PCR验证和酶切鉴定表明,pET-32a-F1被成功构建,并能够高效表达.重组质粒pET-32a-F1诱导的最佳IPTG浓度为0.3 mmol·L~(-1),最佳诱导时间为5 h,最佳诱导温度为37℃;咪唑洗脱浓度为80 mmol·L~(-1)时,能获得较单一的洗脱蛋白.此外,本试验制备的F1多克隆抗体的效价可达1∶1 024 000.

为深入研究富含亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat,LRR）在机体先天免疫过程中的作用机理，以莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）为模式生物，通过生物信息学预测分析CrLRR-1蛋白的二级结构、亲水性及免疫原性等理化性质，人工设计并合成特异性肽段，与钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）偶联后免疫新西兰白兔。结果显示：采用间接ELISA法测定抗血清效价达到1∶512 000，将抗血清依次经Protein A和抗原亲和纯化后得到CrLRR-1蛋白多克隆抗体；利用免疫印迹与免疫荧光检测制备的抗体，该抗体可特异性识别莱茵衣藻内源LRR-1蛋白，且CrLRR-1蛋白主要定位于细胞膜。结果表明，成功制备CrLRR-1蛋白多克隆抗体。

【目的】制备猪流行性腹泻病毒（PEDV）CH-HeB14毒株S1蛋白的多克隆抗体，为 PEDV 新流行毒株诊断试剂盒和疫苗研制提供基础材料。【方法】利用RT-PCR扩增PEDV CHHeB14毒株S1基因，对序列特征进行生物信息学分析，用PCR将S1基因截成不同片段（S1A、S1B、S1C、S1C-1和S1C-1），分别克隆至原核表达载体pET28a,转化BL21(DE3)构建重组表达菌株；用IPTG诱导重组蛋白表达，并进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。将表达蛋白与佐剂乳化制

【目的】制备大口黑鲈蛙虹彩病毒主衣壳(MCP)蛋白兔多克隆抗体,以期为该病毒蛋白功能研究奠定基础。【方法】对p ET32a(+)MCP/BL21重组大肠杆菌进行诱导表达,将重组蛋白进行纯化、复性,以此为抗原免疫大耳兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,间接免疫荧光试验(IFA)和Western Blot法分析MCP多克隆抗体的特异性。【结果】纯化的MCP重组蛋白条带特异;间接ELISA结果显示,制备的兔多克隆抗体血清效价为1∶1 024 000;IFA和Western Blot检测结果表明该多抗特异性良好,能够与大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白发生特异性反应,IFA试验表明血清最适稀释度为1∶500。【结论】成功制备了大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP兔多克隆抗体,该抗体可特异性识别大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白。

NLRP3作为经典的模式识别受体,与ASC和pro-caspase1等蛋白组成NLRP3炎症小体,是鱼类细胞焦亡的主要激活途径。为深入探究大口黑鲈(Micropterus salmoides)中NLRP3相关功能,以大口黑鲈(Micropterus salmoides)cDNA为模板扩增Msnlrp3区段并构建pET-32a-MsNLRP3原核重组质粒,随后将上述重组质粒转化到BL21 (DE3)感受态细胞后以0.8mmol/L的IPTG于16℃过夜诱导重组蛋白的表达。通过亲和层析纯化对获得的上清蛋白液进行纯化,并以SDS-PAGE和质谱分析法对获得的MsNLRP3重组蛋白进行鉴定,从而确认MsNLPR3原核表达系统构建成功。将上述纯化的MsNLRP3蛋白分别免疫日本大耳兔(1只)和Balb/C小鼠(3只)制备多克隆抗体,通过ELISA和Western blotting法检测抗体的效价和特异性。结果表明,免疫后获得的4种抗血清能特异性识别NLRP3重组蛋白和大口黑鲈内源性蛋白,表现出单一而清晰的目的条带,且分子量大小与预期一致;同时兔源和鼠源抗血清效价分别为1∶10240 K和1∶1024 K。为验证抗体的应用效果,首先构建柱状黄杆菌浸泡感染大口黑鲈的模型,大口黑鲈鳃表现出明显的组织病理学变化;应用本研究制备的多克隆抗体进行蛋白质印迹分析,检测到鳃中NLRP3蛋白水平在细菌感染后显著上调。本研究制备的MsNLRP3多克隆抗体为未来开展大口黑鲈NLRP3蛋白的功能研究提供了重要的基础。

为探讨干扰素3(Interferon 3,IFN3)在抗病毒免疫应答中的作用,以草鱼(Ctenopharyngodon idella)巨噬细胞cDNA为模板,PCR扩增IFN3成熟肽基因序列,制备草鱼IFN3蛋白的多克隆抗体,同时研究了IFN3在草鱼不同免疫组织中的蛋白表达,以及草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)感染草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idella kidney,CIK)后不同时间点的表达。结果显示,细菌表达的重组IFN3大小约为45 kD,主要以包涵体形式存在;抗体效价约为1∶3 200,制备的多克隆抗体既能识别原核表达的重组蛋白,也能识别个体水平上和细胞水平上的内源蛋白。草鱼主要免疫组织中,肝胰腺和皮肤检测到相应条带。CIK细胞感染病毒后12 h开始检测到IFN3蛋白,随感染时间的延长,IFN3蛋白表达量有所增加。蛋白水平上检测IFN3的表达,为深入研究草鱼的抗病毒免疫机制奠定了基础。

应用RACE技术克隆了青虾(Macrobrachium nipponense)的Hc基因全长cDNA序列,并对该基因序列特征进行了分析。青虾Hc基因cDNA全长2 235 bp,包括10 bp的5′末端非翻译区(UTR),2 074 bp的开放阅读框(ORF),151 bp的3′UTR,开放阅读框编码688个氨基酸。蛋白相似度比对显示,青虾血蓝蛋白含有典型的6个保守的铜离子结合位点。系统进化树分析表明,青虾Hc与脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)Hc聚在一起,具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示,Hc基因在青虾不同组织中均有表达,其表达量在肝胰腺中最高;使用荧光定...

【目的】制备抗Zhangfei蛋白的单克隆抗体,并鉴定其特性。【方法】用Zhangfei融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0融合,筛选出阳性克隆,应用有限稀释法筛选抗Zhangfei蛋白的单克隆杂交瘤株;采用腹水诱生法制备单抗腹水,用饱和硫酸铵法纯化腹水抗体;采用间接ELISA、单克隆抗体亚型检测试剂盒、免疫印记技术、曲线拟合方案等分别鉴定单抗效价、亚型、特异性和亲和力等特性。【结果】免疫小鼠的血清抗体效价达1∶5 000以上,细胞融合克隆率为98.96%,阳性克隆率为30.18%,筛选出2株抗Zhangfei蛋白的单克隆杂交瘤细胞,其培养上清效价均达到1∶800,腹水单...

为了筛选P1病毒VP1蛋白的特异性单抗,通过生物信息学软件预测其抗原表位,然后利用SEALTM方法制备针对不同抗原表位的单抗,再通过免疫组化试验和Western Blot对其中6株进行分析,筛选敏感性强、特异性好的单抗。结果显示,选取的6株单抗中有3株(mAb1、mAb6和mAb9)在免疫组化染色时呈阳性反应,有1株(mAb1)在Western Blot中表现强阳性。研究筛选出了P1 VP1蛋白的特异性单抗,为P1病毒的检测和疫苗研究奠定了基础。

利用ＲＴ－ＰＣＲ的方法从感染水稻矮缩病毒（ＲｉＣｅ ｄｗａＲｆ ｖｉＲｕｓ，Ｒｄｖ）的水稻中克隆该病毒的运动蛋白基因ｓ６和外壳蛋白基因ｓ８，通过ＧａＴｅｗａｙ系统进行原核表达，获得表达载体Ｐ ｄｅｓＴ１７－Ｐｎｓ６和Ｐ ｄｅｓＴ１７－Ｐ８，将表达载体转化ｅ．Ｃｏｌｉ ＲｏｓｅＴＴａ，经ｉＰＴＧ诱导表达后获得分子质量约为５９和４６ ｋｕ含Ｈｉｓ标签的融合蛋白．以诱导表达的目的蛋白为抗原，免疫注射新西兰大白兔制备多克隆抗体．结果表明，ｗｅｓＴｅＲｎ ｂｌｏＴ检测制备的Ｐｎｓ６和Ｐ８抗体可特异性检测Ｒｄｖ，间接ｅｌｉｓａ测定Ｐｎｓ６和Ｐ８抗体的效价均约为６ ４００倍，并建立了可靠、灵敏、特异的ｄｏＴ．．．

为探讨玉米AGPL2在籽粒发育时期淀粉积累过程中的功能机制,通过AGPL2基因克隆和构建带有GST标签的原核表达载体PGEX-6 T-1-AGPL2,并利用大肠杆菌诱导表达体系,用0. 5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在28℃条件下诱导表达6 h后,GST-AGPL2融合蛋白能够得到高水平表达,然后利用GST(Glutathione S-transferase)标签蛋白纯化介质进行亲和层析纯化,能够得到质量较高的GST-AGPL2融合蛋白;利用纯化所得的GST-AGPL2重组蛋白免疫新西兰大白兔制备了AGPL2多克隆抗体,分离并纯化抗血清,然后用rTEV Protease去除抗原GST-AGPL2融合蛋白的GST标签,并用纯化后的AGPL2多克隆抗体进行Western Blot检测,结果发现,AGPL2多克隆抗体具有较高特异性和灵敏性,可用于检测纳克级抗原蛋白;并利用Western Blot方法研究了AGPL2蛋白在玉米不同组织和不同授粉时期胚乳中的分布和表达模式,结果显示,AGL2蛋白在玉米不同组织中的表达具有组织特异性,且在胚乳中含量最高。AGPL2蛋白在玉米胚乳不同授粉时期表达量先增加后降低,且在授粉中期达到最大值。其结果与玉米籽粒发育过程中淀粉的积累规律一致,说明AGPL2主要存在于玉米胚乳中,且可能参与淀粉的合成,也说明AGPL2多克隆抗体具有很好的特异性,能够识别玉米体内的AGPL2抗原。

为了对鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)ORF136基因编码蛋白进行功能研究和血清学诊断,本实验通过对ORF136基因推导的第31157位氨基酸序列进行PCR扩增,并与原核载体pET-32a(+)连接,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态后进行IPTG诱导表达,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus)以制备ORF136多克隆抗体,运用Western blot和间接免疫荧光技术对抗体进行鉴定。结果表明,重组融合表达蛋白大

【目的】原核表达奶山羊表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)蛋白胞外区25-644位共620个氨基酸序列(ECD序列),纯化蛋白并免疫家兔,制备针对山羊EGFR蛋白的特异性多克隆抗体,为山羊EGFR蛋白功能研究奠定基础。【方法】以pMD19-T-EGFR为模板,采用PCR方法扩增得到EGFR胞外区(ECD)基因序列。将ECD序列连接pET-32a(+)质粒构建pET-32a(+)-ECD原核表达载体,将该重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导