【背景】轮状病毒（Rotavirus,RV）是全球范围内幼儿和各种幼畜急性病毒性胃肠炎的主要原因之一，在公共卫生中具有重要意义。猪轮状病毒病是一种由猪轮状病毒（Porcine Rotavirus,PoRV）引起的一种急性肠道传染病，常造成仔猪消化道功能紊乱，引发严重的呕吐、腹泻和脱水症状，一旦爆发将对养猪业造成重大经济损失。目前，针对PoRV感染尚无特效药物治疗，疫苗接种是控制感染的最经济的途径。然而，PoRV基因型多且易变异，不同基因型之间的交叉保护很不理想。因此，亟需加强对PoRV的流行病学监测和致病机制研究，探索新型防控策略。【目的】利用大肠杆菌原核系统表达PoRV NSP2、NSP4和NSP5非结构蛋白并免疫家兔获得相应多克隆抗体，为PoRV的防控和致病机制研究提供技术手段。【方法】将PoRV的NSP2、NSP4和NSP5基因进行密码子优化后，克隆到pCold-sumo载体中。将测序正确的阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导获得重组蛋白。利用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达情况。对重组蛋白进行亲和层析柱纯化和定量后，采用皮下多点注射方法接种新西兰大白兔，每隔14 d加强免疫一次，经过3次免疫后制备多克隆抗体。采用间接ELISA方法测定多克隆抗体的效价、间接免疫荧光（IFA）和Western blot验证多克隆抗体与PoRV的反应性。再通过Western blot进一步检测PoRV感染过程中3个非结构蛋白的动态表达，以及鉴定3个重组真核质粒转染的效果。【结果】NSP2、NSP4和NSP5重组菌能够有效表达目的蛋白，SDS-PAGE分析可在目标位置清晰观察到明显条带，并且目的蛋白以可溶性形式存在。3个重组蛋白制备的多克隆抗体，ELISA效价均超过1﹕81 000，表明重组蛋白免疫原性良好。IFA结果表明3个多克隆抗体均能够与优势流行基因型轮状病毒发生特异性反应，与其他常见腹泻病原无反应。Western blot结果也展示了研究制备的NSP4、NSP5多克隆抗体可用于病毒感染过程中非结构蛋白的动态表达以及真核质粒转染的鉴定。而NSP2多克隆抗体未能特异性识别到PoRV感染后的NSP2蛋白的表达，但特异性检测到NSP2重组质粒转染后的NSP2蛋白表达，这一结果可能与NSP2的表达特性有关，有待进一步研究确认。随后进行的真核质粒转染验证以及PoRV感染过程中非结构蛋白的动态表达检测结果也验证了本实验制备多克隆抗体的实用性。【结论】成功利用大肠杆菌表达了PoRV的NSP2、NSP4和NSP5非结构蛋白，并获得效价高、特异性良好的多克隆抗体，为PoRV致病机制研究和防控技术研发奠定基础。

【目的】构建重组兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)VPg(Viral Protein Ge-nome-Linked,VPg)蛋白基因的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达和纯化VPg蛋白,制备多克隆抗体,并检测抗体的基本特性。【方法】用PCR方法扩增RHDVVPg基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导,使之重组表达VPg蛋白,并用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。PCR扩增获得了345bp的VPg基因,用纯化的重组VPg蛋白免疫试验兔,制备抗VPg的多克隆抗体,用Wes...

为研究L蛋白在乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus, SHVV)增殖过程中发挥的作用,扩增SHVV L基因的前900个碱基,将其克隆到载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET32a-L,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。设置不同温度、IPTG浓度及诱导时间,选择最佳的表达条件。通过NI-NTA亲和层析柱纯化蛋白,并利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。用Western blot鉴定抗体特异性,间接免疫荧光观察L蛋白在SHVV感染斑点叉尾鮰卵巢细胞(channel catfish ovary, CCO)中的定位情况。结果显示,纯化的L蛋白分子质量约42 ku,与预期大小相符。制备的L蛋白多克隆抗体可以与L蛋白发生特异性免疫反应,且L蛋白主要定位在细胞质,表明L蛋白多克隆抗体制备成功。

以鲤春病毒血症病毒(Spring Virernia of Carp Virus,SVCV)shlj1分离株基因组RNA为模板,利用RT-PCR扩增获得SVCV糖蛋白(Glycoprotein,G)部分基因序列(420 bp),克隆至pET-32a原核表达载体,构建重组质粒pET-32a-G;将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta表达菌株,利用SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)对截短G蛋白的表达及纯化情况进行检测;将纯化的G蛋白免疫小鼠制备鼠抗血清,采用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和细胞间接免疫荧光抗体试验(Indirect fluorescent antibody test,IFAT)对抗血清进行鉴定。SDS-PAGE结果显示该重组截短G蛋白与预期大小相符(约为35 kDa),以包涵体的形式表达;ELISA结果显示,制备的鼠抗截短G蛋白血清效价为1∶80 000;IFAT结果显示,抗血清能够识别不同地区的SVCV分离株(黑龙江省3株,辽宁省2株),在FITC标记的羊抗鼠IgG作用下,呈特异性绿色荧光。结果表明,制备的截短SVCV G蛋白具有良好的免疫原性,利用其所制备的抗体能够识别我国不同SVCV分离株病毒表面天然结构的糖蛋白。

用ＲＴ－ＰＣＲ从感染番茄环纹斑点病毒（ＴｏｍａＴｏ ｚｏｎａＴｅ ｓＰｏＴ ｖｉＲｕｓ，Ｔｚｓｖ）的番茄中扩增出编码病毒非结构蛋白ｎｓｓ基因，将ｎｓｓ基因构建到原核表达载体Ｐ ｅＴ－３０ ａ中，获得原核表达载体Ｐ ｅＴ－３０ａ－ｎｓｓ，转化大肠杆菌ＢＬ２１（Ｄｅ３），用ｉＰＴＧ诱导表达。ｓＤｓＰａＧｅ电泳分析显示，高效诱导表达了５７ｋ Ｄａ融合蛋白。用回收纯化的融合蛋白免疫家兔，获得多抗血清。间接ｅＬｉｓａ测定多抗血清的效价为１／８１９２。用制备好的抗血清对Ｔｚｓｖ感病病样进行ＷｅｓＴｅＲｎ ＢＬｏＴＴｉｎＧ检测，能检测到特异性条带。结果表明该抗血清可用于Ｔｚｓｖ的检测，并为进一步研究ｎｓｓ功．．．

用RT-PCR从感染番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)的番茄中扩增出编码病毒非结构蛋白NSs基因,将NSs基因构建到原核表达载体p ET-30 a中,获得原核表达载体p ET-30a-NSs,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDSPAGE电泳分析显示,高效诱导表达了57k Da融合蛋白。用回收纯化的融合蛋白免疫家兔,获得多抗血清。间接ELISA测定多抗血清的效价为1/8192。用制备好的抗血清对TZSV感病病样进行Western blotting检测,能检测到特异性条带。结果表明该抗血清可用于TZSV的检测,并为进一步研究NSs功...

新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是导致石斑鱼养殖严重经济损失的主要病原体。本研究构建了含有新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)ORF086基因的重组表达质粒载体pET32a-ORF086,将其转化到大肠杆菌中进行融合表达,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,证实重组大肠杆菌融合表达了SGIV ORF086蛋白。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isoprophl-thio-β-D-galactopyranoside,IPTG)浓度、诱导温度、诱导时间等诱导表达条件的优...

【目的】原核表达鸡细小病毒（ChPV）的NS1和VP2蛋白，制备其多克隆抗体，为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立血清学诊断方法提供物质基础。【方法】通过合成ChPV GX-Ch-PV-21毒株的NS1和VP2蛋白基因序列，构建原核重组表达载体pET-32a-NS1和pET-32a-VP2，将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌transsetta感受态细胞进行原核表达，优化表达条件，以十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳和免疫印迹（Western-blotting）方法鉴定NS1和VP2蛋白的表达情况。将表达产物免疫无特定病原体（SPF）鸡获得多克隆抗体，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法测定其效价，以Western-blotting和间接免疫荧光试验(IFA)对多克隆抗体进行鉴定。【结果】SDS-PAGE分析结果显示，NS1和VP2蛋白条带大小分别约为104.0和87.0 kD，与预期条带大小相符。对重组质粒pET-32a-VP2和pET-32a-NS1进行最佳诱导条件筛选，结果显示NS1蛋白表达的最佳诱导条件为异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）终浓度1.0 mmol/mL，16 ℃诱导表达过夜；VP2蛋白表达的最佳诱导条件为IPTG终浓度0.8 mmol/mL，20 ℃诱导表达过夜。可溶性分析结果显示，NS1和VP2蛋白主要以包涵体形式存在；间接ELISA检测NS1和VP2蛋白的多克隆抗体效价均为1︰10240000；Western-blotting鉴定结果表明，His标签蛋白和相对应的鸡多克隆抗体均能与NS1和VP2蛋白特异性结合；IFA分析结果显示，VP2和NS1蛋白多克隆抗体均能与ChPV特异性结合。【结论】成功表达ChPV的NS1和VP2蛋白和制备的鸡多克隆抗体，可作为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立ChPV血清学诊断方法的基础材料。

用RT-PCR从感染烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的烟草样品中克隆该病毒的外壳蛋白基因,病毒外壳蛋白基因再亚克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,构建成重组原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导、Ni+NTA亲和柱纯化获重组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔,制备TMV外壳蛋白多克隆抗体,并用制备的多克隆抗体建立了更简便、经济、特异性更强的DOT-ELISA检测法。

【目的】构建兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】以保存的VP60基因的质粒(pTeasy-VP60)为模版,用PCR方法获得VP60基因,并将其克隆到pET28a(+)载体上,构建重组表达载体pET28a(+)-VP60,酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,优化诱导表达时间和IPTG浓度;利用镍离子螯合层析纯化重组蛋白,并制备了高效价的抗VP60多克隆抗体。【结果】成功构建了兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达质粒pET28a(+)-VP60,其在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,重组蛋白分子质量为60ku,制备的...

为获得斑点叉尾鮰疱疹病毒ORF6和ORF10基因,设计特异性引物进行PCR扩增,成功构建pET-32a-ORF6和pET-32a-ORF10原核表达载体,经IPTG诱导后目的蛋白在大肠杆菌中成功表达并制备多抗,通过Western blot证明ORF10的抗体具有特异性,且ORF10为病毒的结构蛋白。

【目的】旨在构建轮状病毒(Rotavirus, RV)非结构蛋白1(NSP1)和3(NSP3)真核表达载体，并在人胚肾上皮HEK239T细胞中表达，随后研究轮状病毒NSP1和NSP3在体外初步影响IFN-β/ISRE报告基因活性。【方法】首先合成猿轮状病毒SA11株NSP1、NSP3编码基因连接到克隆载体pUCm-T上，通过PCR技术扩增目的片段，再以真核表达载体pRK-Flag、pRK-HA为骨架构建出可特异性表达重组蛋白pRK-Flag-NSP1/pRK-HA-NSP1、pRK-Flag-NSP3/pRK-HA-NSP3的真核表达质粒，经酶切及测序鉴定正确后将质粒转染到HEK293T细胞中，通过Western blot鉴定NSP1/NSP3蛋白的表达。随后，将重组质粒pRK-Flag-NSP1/pRK-Flag-NSP3与IFN-β-Luc/ISRE-Luc质粒共转染至HEK239T细胞，经RIG-IN(RIG-I活化结构域)的刺激后利用双荧光素酶报告基因系统判定NSP1/NSP3蛋白对IFN-β/ISRE报告基因活性的影响。【结果】成功克隆了NSP1和NSP3全长基因，构建了猿轮状病毒SA11株NSP1、NSP3蛋白真核表达质粒pRK-Flag-NSP1/pRK-HA-NSP1、pRK-Flag-NSP3/pRK-HA-NSP3,并在HEK293T细胞中转染表达，Western blot确定了NSP1和NSP3蛋白成功表达。重组质粒pRK-Flag-NSP1和pRK-Flag-NSP3可显著降低RIG-IN诱导的双荧光素酶活性。【结论】NSP1和NSP3蛋白可抑制RIG-IN刺激的IFN-β和ISRE启动子活性，证明NSP3蛋白和已报道的NSP1蛋白一样具有抑制IFN-β信号通路的功能，为深入研究NSP3蛋白调控Ⅰ型干扰素信号通路的作用机制奠定理论基础。

根据鲤春病毒血症病毒(SVCV)基因组序列(GenBank:NC_002803),人工合成M基因开放阅读框序列,克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化工程菌株BL21(DE3),在0.1 mmol.L-1 IPTG、37℃下诱导5 h,获得高效表达的M蛋白,但其主要以包涵体的形式存在,经超声破碎、包涵体纯化后,再经Ni亲和层析柱纯化,获得高纯度的M蛋白.以纯化的M蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备了M蛋白的多克隆抗血清.ELISA检测显示抗血清的效价达1∶128000;western blot分析显示抗血清能够识别SVCV的M蛋白,表明其具有较好的灵敏性和特异性.

鲤春病毒血症病毒(SVCV)能够引起鲤科鱼类大量死亡,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须申报的重要疫病,也是我国唯一被列为一类疫病的鱼类传染病。为建立SVCV的快速免疫学诊断方法,研究其主要结构蛋白间的免疫原性差异,实验首先采用原核表达系统克隆并诱导表达,纯化SVCV的核蛋白(N)、磷蛋白(P)和基质蛋白(M),并进一步免疫新西兰白兔制备抗血清,抗血清经Protein A柱进一步纯化获得3种蛋白的多克隆抗体。利用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫印迹实验(Western blot)对抗体效价和特异