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[期刊] 中国农业科学
[作者]
王赟 窦忠英 乔海 赵婷 杨春荣
【目的】探寻一种简单的胰腺干细胞的分离方法,以便为糖尿病的细胞治疗研究提供丰富的种子细胞。【方法】采用胰酶消化法分离获得细胞,利用仅含有5%的血清的RPMI1640培养基培养细胞,低浓度的血清使得细胞大量死亡漂浮,只留下少数贴壁的小圆细胞。而后将血清浓度提高到15%以上继续培养;采用免疫组化方法对获得的细胞是否具有胰腺干细胞特征予以检测,并测定了细胞的生长曲线。【结果】在血清浓度提高后每个小圆细胞能快速增殖并形成一个克隆,经过这样增殖后的细胞可以连续传代,目前已传至60代。经免疫组化检测,细胞表达PDX-1、GLUT-2、vimentin等胰腺干细胞的标志;细胞也表达Glucagon、insu...
关键词：
胎猪 胰岛 胰腺干细胞 糖尿病
[期刊] 中国农业科学
[作者]
冯若鹏 张慧茹 窦忠英
目的分离培养胎猪胰腺干细胞对其进行功能检测。方法用先悬浮后贴壁的方法从胎猪胰岛获得胰腺干细胞,用免疫组化方法鉴定该细胞,以MTT法测定其不同代次的生长活性,诱导该细胞成为胰腺内分泌细胞并检测其功能。结果分离得到的细胞不表达nestin,而表达导管上皮细胞标志ck-19、平滑肌标志α-actin,其在体外的生长行为有类似胚胎干细胞样生长形态,细胞体外增殖活力很强,现已传至18代,细胞经诱导后分化为分泌胰岛素的胰腺内分泌细胞,并且伴随着细胞超微结构的改变。结论通过本方法可以分离到胎猪胰腺干/祖细胞,经诱导分化可形成有功能的胰岛样细胞团并释放胰岛素。
关键词：
胎猪 胰岛 胰腺干细胞 培养 诱导分化
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
冯若鹏 张慧茹 窦忠英
对新生仔兔胰腺干细胞的分离、培养方法进行了研究,并检测了其横向诱导分化为心肌、成骨、神经细胞的潜能。结果表明,分离到的新生仔兔胰腺干细胞为上皮样细胞,在传代过程中该细胞的生长特性未发生改变,并始终表达导管源胰腺干细胞的标志CK-19,PDX-1;新生仔兔胰腺干细胞经诱导可分化为心肌、神经和成骨细胞,经免疫组化染色鉴定显示,心肌样细胞表达-αactin、神经样细胞表达NF-200而不表达GFAP、成骨样细胞茜素红染色呈阳性。证明该细胞具有多潜能性,是一种亚全能干细胞。
关键词：
新生仔兔 胰腺干细胞 诱导分化
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
韩雅婷 杨学义 徐小明 史明艳 窦忠英
采用酶消化法和组织块法对小鼠、奶山羊、奶牛和家猪的表皮干细胞进行了分离、培养。结果表明:酶消化法适于小鼠表皮干细胞的分离,所获得的小鼠表皮干细胞在维持了两代之后自发分化为神经样细胞;奶山羊和奶牛不论用酶消化法还是组织块法都可以获得大量活力相对较好、表皮干细胞特性维持较久的细胞,奶山羊表皮细胞采用型胶原分选,用有血清培养液培养,经免疫细胞化学鉴定为表皮干细胞,可持续传至少9代,随着代数增高,细胞活力减弱。
关键词：
表皮干细胞 分离 培养 鉴定
[期刊] 华北农学报
[作者]
裴沛 熊慧 崔鹏 关伟军 马月辉
为建立鸡小肠上皮干细胞(Intestinal epithelial stem cells,IECs)体外培养体系并对其进行生物学特性研究,取18日龄鸡胚,分离小肠获得IECs,在DMEM/F12培养基中培养并观察其形态。通过传代及生长曲线的绘制分析其增殖情况,并经形态学观察及细胞免疫组织化学、RT-PCR等方法对所得到的纯化后的鸡小肠上皮干细胞进行鉴定。结果表明,鸡IECs可在体外扩增培养,目前传代至P11,纯化所得的鸡小肠上皮细胞经形态学观察及免疫荧光、RTPCR法鉴定为阳性,由此可得出结论:鸡小肠组织中可以分离出IECs,且能够在体外增殖培养。
关键词：
鸡 小肠上皮干细胞 分离培养 鉴定
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
孙秀柱 朱艳娇 杜丽娟 王立强 康孟阳 王淑辉
为探索提高精原干细胞分离和体外培养效率的技术方法,以建立长期稳定的动物精原干细胞培养体系,对动物精原干细胞的分离纯化和体外培养的研究进展进行综述。以"Spermatogonial stem cell,Isolation,Culture,Enrichment,in vitro"和"精原干细胞、分离、培养和体外扩增"为检索词,查阅精原干细胞相关文献,并进行归纳整理。精原干细胞分离主要有机械分离法和酶消化法,纯化精原干细胞的方法有差速贴壁法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、流式细胞法等,目前大动物精原干细胞的富集常
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李延清 刘霞
为了确定大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)体外分离和培养的方法,建立了稳定的MSCs体外培养扩增体系,通过密度梯度离心和贴壁筛选法分离培养大鼠MSCs,观察了细胞的形态,研究了其增殖及生长特征,并应用流式细胞术测定了细胞周期及CD29,CD44,CD45和HLA-DR的表达。结果表明,在体外培养条件下大鼠MSCs贴壁生长,为成纤维细胞样;CD45和HLA-DR的表达呈阴性,CD29和CD44的表达呈阳性;细胞周期的G0/G1期约占95%,具有原始细胞的特征。说明建立的体外培养扩增体系可获得形态单一、生长稳定、增殖性较强、较均一的大鼠MSCs。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
樊懿萱 张艳丽 杨岳 王子玉 宋辉 闫益波 钟部帅 孟立 聂海涛 葛婷 王锋
为建立梅山猪骨髓间充质干细胞(BMSC)体外分离培养方法及对梅山猪BMSC的生物学特性进行分析,本研究采用全骨髓法分离培养并传代梅山猪BMSC,倒置相差显微镜下观察细胞形态,以计数法检测细胞增殖状况,流式细胞术检测细胞周期,细胞压片进行染色体分析,免疫细胞化学和RT-PCR法检测细胞表面标志和转录因子的表达情况,并检测成骨和成脂分化能力。结果显示:梅山猪BMSC体外生长良好,细胞形态呈成纤维细胞样,具有稳定分裂增殖能力;CD29、CD44、CD90等表面标志基因及Fou5F1、Sox2、Nanog等转录因子基因表达呈阳性,CD45、Lin28表达呈阴性;在特定诱导液作用下,BMSC可分化为成骨...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭志林 王新庄 张涌 王木 王轶敏 胡文举
采用大鼠心肌细胞条件培养基对兔胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESC)进行分离、传代培养,研究大鼠心肌细胞条件培养基对兔ESC分离培养效果的影响。结果显示,用SD大鼠心肌细胞条件培养基培养的兔ESC集落呈岛屿状生长,碱性磷酸酶染色呈强阳性,体外分化可形成类胚体状结构,贴壁的类胚体周边会出现许多分化的上皮样细胞或单个散在的细胞;常规冻存后再传代的兔ESC集落具有较为一致的生长特征,并呈现胚胎干细胞集落所特有的岛屿状生长形态;传至第5代的兔ESC集落核型正常率>75％。表明SD大鼠心肌细胞条件培养基可用于兔胚胎干细胞分离培养。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
冯子建 孙娜 郝志立 孙盼盼 张华 范阔海 尹伟 杨惠珍 钟佳 张振彪 王建中 孙耀贵 李宏全
为建立一种快速分离犬原代乳腺上皮细胞的培养方案，本研究旨在从健康泌乳金毛犬的乳汁中分离原代乳腺上皮细胞，接种于两种不同的培养基后传代培养，探讨不同培养基下细胞的生物学特征，提供犬乳腺上皮细胞简单便捷的分离措施及适宜的培养方法。选取泌乳一周的金毛犬在无菌条件下收集乳汁，离心处理后得到乳腺上皮细胞，分别用完全培养基和基础培养基接种培养，经形态学对比观察，间接免疫荧光检测角蛋白8(Cytokeratin 8)表达情况，绘制两种培养基培养下的第3代乳腺上皮细胞生长曲线；探讨完全培养基培养的第6代乳腺上皮细胞的冻存复苏活力。结果表明：1)乳汁分离可得到大量细胞团块，分别接种两种培养基后都会出现“煎蛋样”贴壁细胞，消化传代后两者均有Cytokeratin 8的高度表达；2)接种于基础培养基的细胞前期以聚集在一起的圆形单克隆细胞团块为主，传至第4代仅有少量细胞存活，细胞随着培养时间增加而状态变差，死亡细胞增多；接种于完全培养基的细胞整体呈“鹅卵石铺路样”成片生长，随着传代次数增加细胞状态稳定，细胞生长曲线呈现“S”形；3)完全培养基培养的第6代乳腺上皮细胞冻存复苏后能快速贴壁并分裂增殖。综上，乳汁分离法成功分离犬乳腺上皮细胞，且与基础培养基相比，完全培养基可以更好地维持细胞活性，促进细胞增殖分裂，且不影响细胞冻存后复苏的活力，为后期快速分离犬乳腺上皮细胞提供较优的培养方案。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
潘少辉 胡玥 张姗姗 王静 李飞飞 高志敏 杨春荣 华进联
【目的】从成年昆明小鼠睾丸组织中分离具有多能性的雄性生殖干细胞(Male germline stem cells,mGSCs)。【方法】采用机械法和2步酶消化法分离出成年昆明小鼠的精原细胞,经差速贴壁后,培养在小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)饲养层上,2周后得到类胚胎干细胞(ESCs)样mGSCs。对得到的mGSCs进行碱性磷酸酶(AP)染色、免疫荧光染色、RT-PCR、体内分化等检测。【结果】mGSCs具有类似ESCs的形态和多能性,AP染色呈阳性,免疫荧光Oct4、Vasa染色呈阳性,RT-PCR检测其表达Oct4、Nanog、Sox2等多能性基因和Vasa、C-kit等生殖细胞的标记基因,在...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘大勇 杨学义 窦忠英
采用组织块法和酶消化法对山羊表皮干细胞进行分离,对分离的表皮干细胞进行了免疫组化染色鉴定,并对其进行了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染研究。结果表明,2种方法均能得到山羊表皮干细胞,其中组织块培养法简单易行,组织块可重复利用,但原代细胞脱出时间较长,平均为8 d,且培养季节对细胞脱出时间、原代传代时间、传代数有显著影响;酶消化法周期短,8 d左右即可传代,不同培养季节对细胞克隆形成时间、细胞传代时间和传代数无显著影响,但处理过程繁琐。EGFP基因在转染表皮干细胞24 h后大量表达,转染率达20%~30%,72 h时转染强度最大,荧光可持续5周;转染使细胞增殖能力明显下降。
关键词：
绿色荧光蛋白 山羊 表皮干细胞 转染
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李勇 沈文正 杨春荣 窦忠英
为了探讨神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)在体外培养中的生物学特性,研究不同细胞因子对NSCs分化的影响,试验对大鼠胎儿神经干细胞进行了分离培养,并研究了10,50和100 ng/mL的神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、脑源性神经营养因子(brain derived neruotrophic factor,BDNF)和胶质源性神经生长因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)对NSCs的定向诱导分化作用。结果表明,大鼠胎儿NSCs可在体外增殖并形成典型的神经球,指数增长期在传代后...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
高艺 黄泳 冯贤辀 王维勇 徐永健 龚婷
【目的】研究建立一种高效制备从江香猪睾丸支持细胞（Sertoli cells，SCs）体外分离培养方法，为后续香猪雄性繁殖的科学研究提供细胞材料，为同类小型香猪支持细胞的分离培养提供参考。【方法】采用0.1% Ⅳ型胶原酶和0.25%胰酶-EDTA组合酶消化法消化睾丸组织，差速贴壁法纯化支持细胞，使用含10%胎牛血清完全培养基培养支持细胞，观察其形态特征并记录生长曲线，经苏木精-伊红（HE）染色、RT-PCR及免疫荧光染色进行支持细胞的鉴定。【结果】组合酶法消化后可获得大量生精上皮细胞混悬液，刚分离的支持细胞呈圆形或椭圆形，分离培养5～6 h后SCs贴壁，贴壁后细胞形态呈梭形或不规则形，培养3～4 d后细胞之间呈紧密连接，可清晰观察到细胞核及细胞质中的颗粒状物质或小空泡；SCs分离后1～2 d增殖速度缓慢，培养3～6 d细胞增殖速度加快，活性增强，进入对数生长期，培养7～8 d后细胞增殖速率下降，原代支持细胞生长曲线呈S形；HE染色显示SCs细胞核为深紫色，细胞质呈淡红色；RT-PCR结果显示支持细胞特异性基因WT1、SOX9均表达；免疫荧光染色结果显示特异性基因GATA-4抗体免疫阳性率达90%以上。【结论】成功建立从江香猪睾丸支持细胞的原代培养方法。
关键词：
睾丸支持细胞 分离培养 鉴定 从江香猪
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘俊平 曹鸿国 郑月茂 赵慧英 温叶飞 张涌
采用大鼠心肌条件培养基对昆明白小鼠胚胎干细胞进行分离、消化传代、培养鉴定等,研究大鼠心肌条件培养基在昆明白小鼠胚胎干细胞分离培养中的作用效果。结果显示,SD大鼠心肌条件培养基在昆明白小鼠3.5d囊胚胚胎干细胞集落分离中,所分离的昆明白小鼠胚胎干细胞集落具有岛屿状生长,隆起于饲养层上;碱性磷酸酶染色为强阳性;体外分化可形成类胚体状结构,贴壁的类胚体周边会出现许多分化的上皮样细胞或单个散在的细胞;经过常规冻存传代的胚胎干细胞集落具有较为一致的生长形态,并呈现胚胎干细胞集落所特有的岛屿状生长形态;对传至第5代的小鼠胚胎干细胞集落进行核型分析,小鼠胚胎干细胞核型正常率大于75%。试验证实,SD大鼠心...
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