应用猪肺炎支原体弱毒株配合佐剂CpG鼻腔免疫仔猪,检测呼吸道(鼻黏膜、气管和肺)IgA和IgG分泌细胞的分布与面积变化。30头仔猪随机均分为5组,7日龄首免,鼻腔免疫组10日龄二免,首免后42 d宰杀,取鼻黏膜、气管和肺,利用免疫组化技术检测IgA和IgG分泌细胞。结果表明:应用猪肺炎支原体弱毒株配合CpG鼻腔免疫后6周,鼻黏膜IgA和IgG分泌细胞的面积均极显著增加(P<0.01),气管IgA分泌细胞的面积也显著增加(P<0.01)。而单独应用猪肺炎支原体弱毒株鼻腔免疫或肌肉注射虽然也能显著增加鼻黏膜和气管IgA、IgG分泌细胞的面积(P<0.01),但仍显著低于配合佐剂鼻腔免疫的效果。在肺...

分别在禽流感灭活抗原(H5N2)中添加黏膜免疫佐剂CpG(CpG佐剂组)和重组IL-2(IL佐剂组),经过鼻腔免疫鸡群后研究呼吸道各段抗体分泌细胞的分布和数量变化。结果发现:在鼻腔免疫后第3周和第5周CpG佐剂组肺单位视野中IgA分泌细胞面积显著高于对照组(生理盐水)(P<0.05),CpG佐剂组和IL佐剂组肺和气管、气管叉单位视野中IgG分泌细胞面积和数量均显著或极显著高于对照组(P<0.05或P<0.01);免疫后第5周和第7周CpG佐剂组气管和气管叉单位视野中IgA分泌细胞面积显著高于对照组(P<0.05)。免疫后第7周2个试验组气管叉中IgG分泌细胞数量极显著高于对照组(P<0.01)...

【背景】猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)通过定植猪呼吸道黏膜层，破坏呼吸道炎性反应平衡，引起炎性损伤和持续性感染。短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1蛋白(short palate lung and nasal epithelial clone1,SPLUNC1)是呼吸道黏膜分泌的具有重要抗菌和抗炎功能的蛋白，被认为是呼吸道黏膜面对危险信号时的“信号传感器”。【目的】从Mhp和SPLUNC1相互作用入手，分析Mhp感染对SPLUNC1表达的影响以及SPLUNC1对Mhp引起的炎性反应的调控作用，揭示Mhp引起炎性损伤的新机制，为解决Mhp持续性感染问题提供参考。【方法】利用猪肺炎支原体对猪支气管上皮细胞（porcine bronchial epithelial cells,PBECs）感染模型和猪体感染模型，通过荧光定量PCR、间接免疫荧光和Western-blotting等方法，分别检测Mhp感染后对肺脏中SPLUNC1以及体外PBECs中SPLUNC1转录和表达的影响。克隆并扩增猪源SPLUNC1基因通过酶切鉴定，构建成功SPLUNC1真核和原核表达重组质粒pCDNA3.1-SPLUNC1以及pET28a-SPLUNC1。与此同时，设计靶向SPLUNC1的siRNA干扰片段。利用体外SPLUNC1蛋白孵育、体内呼吸道黏膜SPLUNC1抗体封闭，通过Mhp CCU50检测明确SPLUNC1对Mhp体内外生长的影响。在猪支气管上皮细胞中，通过过表达或siRNA干扰SPLUNC1基因，后感染Mhp，利用Western-blotting、间接免疫荧光以及酶联免疫吸附方法，明确SPLUNC1对Mhp的黏附作用、诱导炎性因子表达以及MAPK信号通路活化的影响。【结果】Mhp感染猪后可引起肺脏实变，主要组织病理表现为肺脏炎性损伤，同时显著上调肺泡灌洗液中趋化因子CXCL8和炎性因子TNFα和IL-1β分泌。Mhp体内外感染后，体内肺脏和体外猪支气管上皮细胞中SPLUNC1的转录和表达均显著下调。以上研究表明，Mhp可诱导肺脏炎性反应，抑制SPLUNC1表达。另一方面，体外PBECs中过表达SPLUNC1后，Mhp感染引起的CXCL8表达显著减少；siRNA干扰SPLUNC1后，Mhp感染引起的CXCL8表达显著增加，表明SPLUNC1负调控Mhp感染引起的CXCL8表达。基于Mhp感染入侵呼吸道过程，本研究进一步解析SPLUNC1负调控CXCL8表达的机制。结果表明：无论是SPLUNC1和Mhp体外孵育，还是SPLUNC1抗体体内封闭，Mhp的体内外生长均未受影响；SPLUNC1的过表达或siRNA干扰对Mhp体外黏附PBECs的能力也无显著影响；过表达SPLUNC1可抑制pERK和IκBα的激活，相反SPLUNC1 siRNA干扰后，可促进pERK和IκBα的激活。以上研究证明SPLUNC1不是通过调控Mhp的生长和黏附，而是通过负调控MAPK-ERK通路的活化来调控CXCL8的表达。【结论】SPLUNC1可通过MAPK-ERK信号通路来调控炎性因子的过度表达，维护宿主炎性平衡；与此同时，Mhp感染后可通过抑制SPLUNC1的表达来破坏宿主炎性反应的平衡调控，进而引起炎性损伤。本研究为解析Mhp感染损伤机制提供依据。

为探讨鸭源禽流感灭活抗原与佐剂配合饮水免疫雏鸭的效果,应用鸭源禽流感灭活抗原与复合黏膜免疫佐剂(CpG和/或葡萄糖)饮水免疫雏鸭,检测消化道(主要是咽和小肠)抗体分泌细胞的变化。首先分别从鸭的胆汁和血清中粗提免疫球蛋白A(IgA)和IgG,经纯化后制备了兔抗鸭IgA和IgG,然后应用免疫组化技术显示鸭消化道IgA和IgG分泌细胞。试验结果表明:用禽流感灭活抗原配合CpG和/或葡萄糖饮水免疫后3、5和7周,消化道黏膜局部IgA分泌细胞面积均显著或极显著增加(P<0.05或P<0.01),IgG分泌细胞(除首免后第3和7周小肠外)极显著升高(P<0.01)。而单独用禽流感灭活抗原和用葡萄糖配合禽流...

用猪繁殖与呼吸综合征 (PRRS) 弱毒苗分别通过生殖道黏膜免疫和肌肉注射免疫母猪 (各 4头 ), 另 4头经生殖道接种生理盐水作为对照, 运用免疫组化技术显示子宫局部IgA分泌细胞和IgG分泌细胞的分布。结果表明, 对照组子宫中IgA分泌细胞和IgG分泌细胞主要分布于黏膜固有层浅层, 子宫颈中的IgA分泌细胞数量多于子宫角, 而子宫角中IgG分泌细胞数量多于子宫颈。生殖道免疫后, 与对照组相比, 子宫角IgA分泌细胞数量极显著增多 (P

【目的】构建绵羊肺炎支原体(MO)p74基因重组单核细胞增生李斯特菌(LM)并分析其免疫原性,为研发MO重组活疫苗奠定基础。【方法】采用PCR方法从LM-SB5株基因组中扩增出rli60基因的上、下游同源片段a和b,从质粒pET-32a(+)-p74中扩增出MOp74目的基因片段,利用重叠延伸PCR方法(SOE-PCR)将扩增的3个片段融合成ap74b基因片段,克隆入pMD19-T载体中进行测序鉴定。将ap74b片段从pMD19-T载体上切下亚克隆入pKSV7穿梭载体,构建pKSV7-ap74b重组穿梭质

【目的】对贵州省疑似绵羊肺炎支原体(Mo)感染山羊病例进行病原确定性诊断。【方法】采集疑似Mo感染山羊肺脏,以支原体专用培养基从其中分离致病支原体,并通过形态学观察、生化试验、血清学试验及分子生物学方法对分离菌株进行鉴定。【结果】分离菌株菌落呈无中心脐圆形凸起,菌体呈多形性,大小在0.2～0.4μm;分离株表现出了与Mo标准株Y98相同的生化特性,在含抗Mo血清培养基中不生长;分离株16SrRNA基因序列与Mo Y98株同源性达99.55%,系统进化树分析与MoGH3-3株进化关系最近。【结论】成功分离到了Mo,为确定本地山羊支原体肺炎病原种类提供了理论依据,并为后续围绕病原进行防控工作研究奠...

将猪瘟病毒弱毒C株ST细胞苗以不同剂量(106 TCID50和105 TCID50)免疫28日龄仔猪,通过临床症状观察、病理剖检和组织病理学观察、抗体检测、特异性淋巴细胞增殖试验及抗原检测等方法评价疫苗免疫效果。结果表明:该疫苗接种仔猪后无任何临床症状,无病毒血症,无排毒现象;不同剂量免疫组,在2免后10 d左右猪瘟特异性抗体阳转,抗体水平于2免后20 d左右达到峰值。以上结果表明,猪瘟弱毒疫苗毒株C株的ST细胞传代疫苗对仔猪安全有效。

为建立一种敏感、特异的检测疫苗中猪肺炎支原体污染的方法,设计了猪源支原体PCR通用外套引物和猪肺炎支原体种特异性内套引物及地高辛标记寡核苷酸探针,建立了PCR-斑点杂交技术,应用于猪瘟活疫苗中猪肺炎支原体污染的检测,并与套式PCR技术进行比较研究。结果显示,探针最低检出DNA量为23.4 pg,比套式PCR(最低检出量为62.5 pg)敏感性更高,且探针与鸡毒支原体和大肠杆菌DNA无交叉反应。对来自6个生产厂家共90批疫苗的检测结果显示,PCR-斑点杂交法比套式PCR法对疫苗猪肺炎支原体污染的检出率高10%。以上结果表明PCR-斑点杂交法具有更高的敏感性和特异性,在疫苗猪肺炎支原体污染的检测中...

【目的】本文研发了MO重组活疫苗。【方法】利用PCR技术从LM-SB5株基因组中扩增出rli60基因上下游同源片段a、b,从pMD19-T-meAg15中扩增出MO meAg15目的片段,采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术将扩增得到的3个基因片段融合成ameAg15b,将其克隆测序鉴定。将ameAg15b目的基因亚克隆到pKSV7穿梭载体,构建pKSV7-ameAg15b重组穿梭质粒,将该重组穿梭质粒电转化至LM-SB5感受态细胞,在氯霉素、高温双重压力筛选重组菌LM-Δrli60-ameAg15b

对疑似为患有绵羊肺炎支原体的刚死病羊无菌采取病料,经直接培养与间接培养后分离到可疑绵羊肺炎支原体。然后对培养生长的支原体分别进行形态学观察、各种生化试验、血清学试验以及药物敏感性试验,最后确诊为绵羊支原体肺炎,并分离得到绵羊肺炎支原体。

为了解猪肺炎支原体流行菌株遗传变异情况,选取2014-2017年不同时间、地点收集的17头猪肺炎支原体阳性屠宰猪肺脏灌洗液DNA为模板,进行猪肺炎支原体P36(编码具有强免疫原性的胞浆蛋白)、P46(编码具有强免疫原性的表面蛋白)、P97 R1区、P146高变区(猪肺炎支原体黏附气管纤毛细胞的重要功能区域)基因的PCR扩增、测序。结合GenBank登录的猪肺炎支原体相关序列进行氨基酸序列的比对分析。结果表明,比对的序列之间,P36、P46蛋白氨基酸序列同源性均在98.9%以上,但P97功能区R1区、P146多变区在菌株间存在较大差异。11个屠宰猪样本和5个GenBank登录菌株P97 R1区重复氨基酸序列数量达到14个以上,而GenBank登录的3个疫苗相关菌株(168株、168-L株、J株)及另外4个菌株、4个屠宰猪样本重复序列为9～11个不等;P146高变区氨基酸序列的差异主要集中在2个重复氨基酸序列区(R1、R2),GenBank登录的168株、168-L株、J株以及另外2个菌株,1个屠宰猪样本在R1区出现较多氨基酸缺失。168株、168-L株,6个屠宰猪样本及另外3个GenBank登录菌株在R2区出现了3～9个不等的氨基酸缺失。利用DNAStar进行抗原表位预测发现,菌株间P97 R1、P146 R1、P146 R2区氨基酸序列的差异,导致了抗原表位出现明显的变化。提示开展P97、P146等黏附因子的筛选和研究或许能进一步提升疫苗阻止猪肺炎支原体黏附气管纤毛细胞的作用,从而进一步改善疫苗的免疫效果。

Toll样受体(TLRs)作为重要的模式识别受体,在动物的天然免疫中发挥重要作用,是机体抵抗感染的第一道屏障;TLRs基因变异会改变机体对病原的抗性或易感性,本试验旨在探讨TLR2、TLR4基因突变与支原体肺炎感染的关系。试验以国外引进猪品种(长白、大白、皮特兰)、中国地方猪品种(梅山、二花脸、姜曲海、金华)以及江苏省培育猪品种(苏钟猪)为材料,通过PCR-SSCP技术检测实验猪群TLR2、TLR4基因SNPs分布,结合动物攻毒实验及文献报道,对其中部分SNP不同基因型猪的肺部巨噬细胞做LPS感染实验,借助RT-PCR跟踪不同时间点猪TLR2、TLR4基因以及促炎性因子TNF-α、IL-1β的...

【目的】建立了一种同时鉴别Ｈ１、Ｈ３亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎、猪圆环病毒病、猪细小病毒病和猪伪狂犬病８种病毒性呼吸道和繁殖障碍病病原体的ＧｅＸＰ高通量检测方法。【方法】根据这８种病原体的基因保守序列，设计并合成了９对特异性引物，在每对特异性引物的５＇端均加上一段通用引物，形成特异性嵌合引物。运用ＧｅＸＰ单重ＰＣＲ方法，以单一病毒ＣＤＮＡ／ＤＮＡ为模板验证引物的可行性；建立ＧｅＸＰ多重ＰＣＲ方法，以单一病毒ＣＤＮＡ／ＤＮＡ模板、阳性ＣＤＮＡ／ＤＮＡ混合模板验证ＧｅＸＰ多重检测体系的特异性和准确性；将含猪圆环病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒靶基因的克隆质粒及体外转录．．．

【目的】检测并验证猪支原体肺炎发生的品种敏感差异,筛选相关差异表达基因,探究猪支原体肺炎发生的分子遗传基础,为猪该病发生的分子机制研究提供依据。【方法】以对肺炎支原体易感的梅山猪、耐受的长白猪及二者杂交选育的苏钟猪为材料,设立试验组(15头/品种)和对照组(5头/品种),试验组猪接种肺炎支原体Js强毒株,对照组猪注射等量生理盐水,所有猪隔离、无抗生素饲养,监测临床表现;处理后18、28 d测定日增重、抗体水平及肺部病变,28d试验结束时集中屠宰,评定肺部损伤,检测病原,确定肺炎支原体感染情况;选择肺炎支原体感染的梅山、长白、苏钟猪各2头,未感染猪各2头,构成芯片杂交试验猪群,应用Agilent...