【目的】探讨猪肌内脂肪细胞与皮下脂肪细胞的基因表达差异。【方法】通过改进的胶原酶消化法,分别从猪(大×长二元杂)皮下脂肪组织和背最长肌肌肉组织中分离脂肪前体细胞,用850nmol·L-1胰岛素和50nmol·L-1地塞米松诱导细胞分化,采用油红O提取法测定细胞分化过程中的聚酯水平。同时采用实时荧光定量PCR方法检测细胞分化过程中的转录调控因子基因(PPARγ、C/EBPβ与SREBP-1)、脂肪合成酶相关基因(GPDH、ACC和SCD-1)、脂肪酸转运相关基因(LPL、FAT与AP2)以及肌肉旁分泌因子受体基因(ACVR2B、IL-6R和IGF-1R)的表达模式。【结果】猪肌内脂肪前体细胞诱导...

［目的］探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒγ，ｐｐａｒγ）在肌内和皮下脂肪细胞中的差异表达及其与脂质差异沉积的关系，并从ｍｉｒＮａｓ角度阐述ｐｐａｒγ基因差异表达的机制。［方法］用油红ｏ染色法检测肌内前体脂肪细胞与皮下前体脂肪细胞的分化聚脂能力；采用ｑｒｔ－ｐｃｒ与ＷｅｓｔｅｒＮ ｂｌｏｔ检测ｐｐａｒγ在肌内脂肪细胞和皮下脂肪细胞中的表达水平；通过生物信息学预测靶向ｐｐａｒγ的ｍｉｒＮａｓ，利用ｑｒｔ－ｐｃｒ检测候选ｍｉｒＮａｓ在肌内脂肪细胞和皮下脂肪细胞中的表达水平；用双荧光素酶报告系统鉴定候选ｍｉｒＮａｓ与．．．

为建立绵羊肌内脂肪前体细胞的体外培养模型,选用组织块法培养绵羊肌内脂肪前体细胞,制备用荧光染料PE(Phycoerythrin)标记的兔抗绵羊Pref-1蛋白的多克隆抗体,通过流式细胞术分离纯化脂肪前体细胞,对纯化后的细胞进行诱导分化以及油红O染色鉴定。结果表明:利用流式细胞仪能分选纯化出被标记的肌内脂肪前体细胞且分选率近30%;纯化后得到的细胞是功能活跃的脂肪前体细胞。研究表明,用绵羊羔羊肌肉组织采用组织块培养法可以建立绵羊肌内脂肪前体细胞培养模型,抗绵羊Pref-1蛋白多克隆抗体可以作为纯化脂肪前体细胞的工具。

［目的］本文旨在研究核受体共激活蛋白２（ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ２，ｎｃｏａ２）对猪肌内前体脂肪细胞分化能力的影响。［方法］用荧光定量ｐｃｒ（ｑｒｔ－ｐｃｒ）法检测ｎｃｏａ２在猪肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达变化；通过ｎｃｏａ２小干扰ｒｎａ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｒｎａ，ｓｉｒｎａ）抑制内源ｎｃｏａ２的表达，并用油红ｏ染色检测沉默ｎｃｏａ２对肌内前体脂肪细胞分化能力的影响，通过ｑｒｔ－ｐｃｒ检测沉默ｎｃｏａ２对脂肪分化关键基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒγ，ｐ．．．

为分析山羊KLF16对肌内前体脂肪细胞分化的调控作用,利用RT-PCR克隆得到山羊KLF16基因序列,利用生物信息学分析山羊KLF16基因序列特征,通过过表达、油红O染色和qPCR等方法从形态学及分子水平分析过表达山羊KLF16后肌内脂肪细胞脂滴积聚及分化标志基因表达水平的变化。结果表明:1)克隆得到包含CDS区的山羊KLF16基因序列986bp,编码251个氨基酸,具有典型锌指结构;2)KLF16在山羊各组织广泛表达,其中腹部皮下脂肪组织表达量极显著高于其他组织(P<0.01);3)过表达山羊KLF16与对照组相比脂肪细胞脂滴积聚减少,分化标志基因PPARγ和PPARα极显著下调(P

【背景】脂肪组织分为皮肤下的皮下脂肪组织(subcutaneous adipose tissue,SAT)和腹部内器官周围的内脏脂肪组织(visceral adipose tissue,VAT),皮下脂肪作为影响肉类美味与否的重要因素,探究皮下脂肪沉积分子调控机制对于育种改良和畜牧业的发展至关重要。Krüppel-like factors 12 (KLF12)是一个进化保守的转录因子,可以在多种细胞类型中表达并控制着广泛的细胞过程。【目的】研究获得山羊KLF12的分子特征并进行生物信息学分析,同时明确KLF12在山羊组织和细胞中的表达模式以及干扰KLF12对山羊皮下脂肪细胞分化的调控作用,为进一步研究KLF12在脂肪沉积过程中的潜在作用提供理论依据。【方法】利用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)方法克隆山羊KLF12完整编码序列(coding sequence,CDS)区,使用在线生物信息学分析软件对山羊KLF12核苷酸序列和氨基酸序列进行分析。利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技术检测KLF12在山羊心脏、肝脏、腹部脂肪、皮下脂肪、臂三头肌、背最长肌等14个组织中的表达水平,以及诱导分化不同时间段KLF12在皮下前体脂肪细胞中的表达水平。随后,试验通过化学合成山羊KLF12小干扰RNA(si-KLF12),使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂将山羊si-KLF12序列转染到体外培养的山羊皮下前体脂肪细胞中。使用100μmol·L-1油酸导液诱导脂肪细胞分化。利用油红O以及Bodipy染色方法和qRT-PCR技术分别从形态学以及分子生物学的角度阐明干扰KLF12对皮下前体脂肪细胞脂滴积聚和脂肪分化标志基因mRNA表达水平的影响。【结果】试验成功获得包含开放阅读框(open reading frame,ORF)(1 209 bp)的山羊KLF12(1 315 bp,编码402个氨基酸)。亚细胞定位结果显示KLF12主要位于细胞核,此外,KLF12无跨膜结构域和信号肽,且在317—341、347—371及377—399氨基酸处存在3个典型的锌指结构域(ZnF_C2H2)。组织表达谱结果显示KLF12在山羊心脏和脾脏的表达水平极显著高于其他组织(P<0.01)。结合形态学观察结果以及脂肪分化标志基因表达水平变化情况,推测KLF12在皮下脂肪细胞分化过程中起到负调控作用。【结论】通过对山羊KLF12的分子生物学特征、组织细胞间的表达规律以及对山羊皮下脂肪细胞分化过程的潜在调控作用的研究表明,KLF12是山羊皮下脂肪细胞分化过程中的负调控因子,并且这种作用可能是通过调控LPL、PPARγ和Pref-1实现的,为进一步探究KLF12在调控脂肪细胞分化过程中的分子机制奠定了基础。

【目的】探讨皮下脂肪和肌内脂肪对猪肉风味的贡献,为改善猪肉产品风味提供理论依据。【方法】在猪瘦肉中添加不同比例或种类的皮下脂肪,或在去脂猪肉中添加肌内或皮下脂肪,热处理后,用GC-MS和电子鼻对各样品的风味进行测定。【结果】在猪肉中添加不同比例或种类的皮下脂肪不会使挥发性风味物质在种类上发生显著变化,只是在部分物质的峰面积上有不同程度改变;偏最小二乘回归(PLSR)和电子鼻分析表明,添加不同种类或比例的皮下脂肪不会引起猪肉整体风味太大的改变。在去脂肉中添加5%的皮下脂肪后,挥发性物质中醛和酮的种类显著增加,总的峰面积增加了50%左右;添加5%的肌内脂肪后,酮和醛的种类也会显著增加,总的峰面积增...

【目的】通过分析西门塔尔牛肌内脂肪和皮下脂肪差异表达miRNA,及对重要的候选miRNA-27b进行靶基因预测及相关生物信息学分析,探索miRNA在动物肌内脂肪生长、发育过程中的作用及其调控机制。【方法】利用miRNA微阵列芯片技术对肌内脂肪和皮下脂肪miRNA表达谱进行检测和分析以筛选差异表达miRNA;qRT-PCR方法验证4个在肌内脂肪显著高表达的候选miRNAs;采用Targetscan生物信息学计算方法预测目标miR-27b(对肌内脂肪沉积可能起重要调节作用)的靶基因,并对靶基因进行GO注释描述、富集分析及KEGG富集。【结果】miRNA芯片分析发现肌内脂肪和皮下脂肪共有88个差异表...

【目的】建立牛前体脂肪细胞的体外分离培养方法,研究牛前体脂肪细胞的生物学特性和分化特征,为研究牛脂肪发育和脂肪沉积的机制提供一种简便有效的细胞模型。【方法】采用Ⅰ型胶原酶消化法自新生牛脂肪组织中获得前体脂肪细胞,对培养的牛前体脂肪细胞进行形态学观察、生长曲线测定、油红O染色及脂肪细胞标志基因LPL、PPAR-r和脂联素表达研究。【结果】80%的牛前体脂肪细胞接种后12h开始贴壁,4d后开始向脂肪细胞转化,10d后绝大部分细胞脂滴融合,细胞脂肪含量增加;分离的牛前体脂肪细胞接种后1~2d生长缓慢,3~8d进入对数生长期,9d后进入平台期,之后细胞数目开始下降。经胰岛素诱导分化过程中,LPL在牛前...

【目的】构建鸡HOPX基因(homeodomain only protein X)全长编码区(coding region sequence,CDS)的真核表达载体,转染鸡原代前脂肪细胞,探讨HOPX基因过表达对鸡原代前脂肪细胞增殖的影响。【方法】利用Primer Premier 5.0软件设计鸡HOPX基因CDS区上、下游引物,以AA肉鸡腹部脂肪组织的cDNA为模板,采用PCR扩增、克隆鸡HOPX基因全长CDS区,并将其亚克隆至真核表达载体(pCMV-HA vector),获得HOPX基因的真核表达载体pCMV-HA-HOPX。采用双酶切鉴定、测序及Western blotting方法分析鉴定...

为了探究lncRNA2099对猪前脂肪细胞增殖分化的影响，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测lncRNA2099在猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背肌和背脂及离体培养的前体脂肪细胞增殖和分化阶段的表达水平；利用核质分离技术确定lncRNA2099在脂肪细胞中的表达位置；构建真核表达载体pcDNA3.1-lncRNA2099,采用qRT-PCR技术检测在脂肪细胞内过表达该lncRNA后对脂肪细胞增殖、分化相关标志基因表达的影响。结果显示：lncRNA2099存在明显组织表达特异性，且在肾脏和背脂中高表达，在背肌中不表达；lncRNA2099在猪前脂肪细胞增殖阶段12 h表达量最高，随后逐渐降低。在分化阶段第2天表达量最高，随后逐渐降低。核质定位结果表明，lncRNA2099在细胞核与细胞质中均有表达；在脂肪细胞内过表达lncRNA2099后，增殖标志基因P21与成脂分化标志基因LPL表达量极显著升高。lncRNA2099可能作为转录调节因子抑制猪前脂肪细胞增殖、促进成脂分化。

为了研究ＰＰＡＲ信号通路在猪去势诱导的脂肪沉积中的作用，采集去势和非去势淮南猪（共６头，每组各３头）的皮下脂肪组织，提取总ＲＮＡ后构建文库，利用高通量测序技术检测ＰＰＡＲ通路相关基因表达量，表达差异基因的筛选阈值为Ｐ１。基于ｍＲＮＡ的差异分析以及ＫＥＧＧ富集分析发现，ＰＰＡＲ信号通路中１７个基因表达差异达到显著水平，其中１４个基因表达量上调、３个基因表达量下调。脑型脂肪酸结合蛋白基因（ＦＡＢＰ７）、甘油水孔蛋白基因（ＡＱＰ７）、视黄素Ｘ受体γ基因（ＲＸＲγ）等基因上调，而磷酸烯醇丙酮酸羧激酶１基因（ＰＣＫ１）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子１α基因（Ｐ．．．

用不同种类、不同浓度游离脂肪酸(FFA)处理体外培养的成熟3T3-L1脂肪细胞,实时荧光定量PCR和Western-blotting分析FFA处理前后脂联素基因mRNA和蛋白质水平的表达差异。结果表明:各类脂肪酸对脂联素mRNA的表达均具有下调作用,且抑制效应呈时间、剂量依赖性;并且各种脂肪酸显著地影响脂联素蛋白的分泌作用。

【目的】腺苷甲硫氨酸转移酶(MAT)在ATP的作用下,催化生成体内重要的甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)。通过构建慢病毒介导的pLenti-H1干扰载体,探究腺苷甲硫氨酸转移酶MAT2A和MAT2B对猪肌内脂肪细胞分化的影响。【方法】无菌条件下采集3—7日龄小猪背最长肌,采用差速贴壁法分离猪肌内脂肪细胞。根据GenBank中猪MAT2A基因序列(AccessionNo.NM_001167650.1)和MAT2B基因序列(AccessionNo.NM_001142832.1),获得其CDS序列。利用Invitrogen公司在线软件BLOCK-iTTM RNAi Designer分别设计shRNA靶序列,将合成的单链寡核苷酸退火形成双链,与经过Bam H I和Xho I (TaKaRa)双酶切后的pLenti-Hl载体连接,转化,并提取质粒进行酶切和测序鉴定。采用X-tremeGENE-HP DNA转染试剂与测序成功的重组质粒以及包装质粒(CMV-Δ8.9和CMV-VSVG)共转染293T细胞,48 h后观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,并进行滴度测定。在猪原代脂肪细胞密度达到70%—80%时,侵染病毒;细胞密度融合时诱导分化。提取分化第8天的猪肌内脂肪细胞的RNA,按照反转录试剂盒操作说明进行反转录,合成cDNA第一链。采用primer primer 5软件设计MAT2A、MAT2B、PPARγ、aP2、CEBP/α、β-actin基因的定量引物,实时定量和Western blot试验检测MAT2A和MAT2B基因的干扰效率。油红O染色和实时定量鉴定MAT2A和MAT2B基因对猪肌内脂肪脂质积累的影响。【结果】酶切及测序证明重组慢病毒载体pLenti-Hl-MAT2A/MAT2B构建成功;包装的慢病毒sh-MAT2A和sh-MAT2B病毒滴度分别为6.7×107和7×107 pfu/mL,侵染肌内脂肪细胞72 h后,可出现90%的绿色荧光蛋白(GFP),表明所包装的病毒可满足侵染猪前体肌内脂肪细胞需要。实时定量结果显示其显著抑制了MAT2A和MAT2B的m RNA水平表达,其干扰效率分别在70%和60%以上;进一步采用Western blot试验及蛋白分析表明,干扰MAT2A基因后,MAT2A蛋白表达水平降低40%左右,差异达到极显著水平(P<0.01);干扰MAT2B基因后,MAT2B蛋白表达水平降低25%左右,差异达到显著水平(P

设置养分贮存损失状态不同的4类培养液,分别添加一定浓度梯度的L-谷氨酰胺(L-G lu tam ine,L-G ln)培养大鼠前体脂肪细胞。通过形态学观察、M TT比色、油红O染色提取法,比较各组细胞形态及增殖与分化的效果。结果表明,添加0 mm o l/L L-G ln的新鲜培养液和配制后4℃冷藏20 d,再添加0.685 mm o l/L L-G ln的培养液,均较利于前体脂肪细胞的增殖与分化;配制后4℃冷藏90 d的培养液,对前体脂肪细胞培养效果较差,添加L-G ln也不能使培养效果得到改善。另外,启封后的M 199和胎牛血清(F eta l C a lf Serum,FCS)分别冷藏不...