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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
马苏 戴建君 李玉峰 段舒怡 姜平
利用重组真核质粒pcDNA3-GP5免疫BALB/c小鼠,取脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0融合,经间接ELISA筛选和3次有限稀释法克隆,得到3株能稳定分泌抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株,分别命名为4C9、5D10、5F12,其中5D10的Ig亚类为IgM。ELISA检测杂交瘤细胞培养上清液抗体的效价为1∶64~1∶1 024,腹水的效价为1∶3200~1∶10240,IFA和IPMA的检测结果均为阳性。Western-blot检测证明,这3株McAb均针对PRRSV的GP5蛋白。中和试验表明,5D10和5F12具有病毒中和活性,中和效价分别...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
严玉霖 高洪 陈玲 陈培富 杨建发 孙文汇 高利波 赵汝
以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)为模板,通过RT-PCR扩增编码非结构蛋白2(Nsp2)的基因,插入到pET32a表达载体中并在大肠埃希氏菌中进行表达。SDS-PAGE电泳结果显示融合表达的Nsp2分子量约为68 kDa,Western blotting分析该融合蛋白能与PRRSV阳性血清发生特异性反应。纯化融合表达产物Nsp2,按100μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化,经腹腔免疫BALB/c小鼠3次后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,分别以Nsp2和His-Tag为抗原,通过间接EL ISA方法对融合细胞的上清液进行检测,筛选阳性克隆。经过3次亚克隆后,最终得到了6株能稳定分泌...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
曹丙蕾 张群 凌宗帅 邱洪凯 杨超然
采集某发病猪场病料进行疑似PRRSV分离鉴定,经克隆测序获得一株美洲型的高致病性PRRSV SD-TA株分离株,并对其N蛋白(核衣壳蛋白)基因设计引物进行克隆转化,构建重组质粒pET-30a-ORF7,鉴定后经诱导表达纯化获得大小约为21KD(含6×His标签蛋白)的重组N蛋白。将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,经间接ELISA检测后取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,并对融合细胞上清进行抗体检测,通过有限稀释法,获得了2株能稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为6D10和3H5,经鉴定后两者均为IgG1型,且识别于不同的抗原位点,经Western-blot和IFA检测,单抗6D10...
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨艳艳 乔松林 李睿 郭军庆 李青梅 滕蔓 王丽 赵东 李学伍 邓瑞广 张改平
为了得到一种能够高通量检测细胞培养物的方法,并将其用于筛选特异性强、敏感度高的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)单克隆抗体。用每孔能感染约100个细胞的病毒量接种单层覆盖96孔板的Marc-145细胞,12 h后用含3%H_2O_2的甲醇固定细胞,以制备免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)反应板。以100μL/孔的量将融合后继续培养10 d的杂交瘤细胞的培养上清加入至IPMA反应板,以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG-HRP作为二抗,以3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)作为显色底物,于倒置显微镜下进行观察。结果表明,共筛选出1D1、7G8等39份PRRSV单克隆抗体,这39份单抗能够使PRRSV中高致病毒株HN07-1和经典毒株BJ-4感染的Marc-145细胞被特异性染色,而对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒感染的Marc-145细胞无交叉染色。因此,构建的IPMA方法能够敏感、准确地捕捉到PRRSV单克隆抗体。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
江云波 方六荣 肖少波 张辉 陈焕春
目的探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)自杀性DNA疫苗的免疫效果。方法将ORF5和ORF6基因分别插入可以同时表达两个外源基因的表达载体pSCA2的26S启动子下游,获得ORF5和ORF6双基因共表达自杀性DNA疫苗pSFV-56。结果Westernblot检测证实ORF5和ORF6基因获得正确表达,并且所表达的GP5和M蛋白可以形成异源二聚体。将pSFV-56免疫Balb/c小鼠,首免后4周可检测到特异性PRRSV中和抗体,首免后8周的中和抗体最高可达1﹕32,同时还可检测到较高的特异性细胞免疫应答。进一步将pSFV-56免疫断奶仔猪,二免后4周即可产生1:8～1:16的中和抗体,直到...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
任慧英 郭鑫 杨汉春 王芳 赵东升 杜希珍
目的检测PRRSVGP5DNA重组质粒在猪体诱导的免疫反应以及细胞因子的佐剂效应。方法将表达PRRSVGP5的DNA重组质粒与表达3种细胞因子的重组质粒联合免疫SPF猪,经3次免疫后人工感染PRRSV,检测体液免疫、细胞免疫以及攻毒保护性反应。结果重组质粒pCI-GP5可诱导免疫猪产生中和抗体,效价达1:19.2,并可诱导机体产生较强的细胞免疫,攻毒后组织中PRRSV核酸的检出率下降39%,表明表达PRRSVGP5的DNA重组质粒pCI-GP5可诱导一定的免疫效力。pcDNA-IL-4与pCI-GP5共免可将中和抗体效价提高到1:35.5,且可增强细胞免疫反应,与对照组相比,病毒血症的出现频率...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
苏晓鸥 乔俊文 赵德明 杨利峰 周向梅 尹晓敏 杨建民
以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳蛋白(rN蛋白)为抗原,初步建立了检测PRRSV抗体的rN-ELISA方法。根据GenBank公布的PRRSV VR2332株编码核衣壳蛋白的ORF7基因序列设计合成了一对引物,成功扩增出ORF7基因。将其克隆到PET-30a构成原核表达载体,转化宿主菌BL21(DE3)并获得表达。通过SDS-PAGE和Western blot检测证实rN蛋白获得了高效表达,且具有良好的免疫学活性。以纯化的重组蛋白为抗原建立检测PRRSV抗体的间接ELISA法。试验证明,该方法与IDEXX公司生产的PRRSV抗体检测ELISA试剂盒对同批临床血清样本的检测结果完...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
蔡家利 姜平 简中友 马志勇 蔡宝祥
猪繁殖和呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）Ｍ和Ｎ蛋白基因扩增与克隆蔡家利姜平简中友马志勇蔡宝祥（南京农业大学畜禽传染病研究室，南京２１００９５）ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮＡＮＤＣＬＯＮＩＮＧＯＦＭＡＮＤＮＰＲＯＴＥＩＮＧＥＮＥＯＦＰＯＲＣＩＮＥＲＥＰＲＯ...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
郑其升 杨瑞锋 毕志香 李鹏 于春梅 曹瑞兵 陈溥言
根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)VR2332株的核酸序列设计并合成1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV NJ-a株ORF6基因,将其连接入pMD18-T载体,经测序后克隆入原核表达载体pET-32a(+)上,构建原核表达载体pET-ORF6。阳性质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经异醛-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,PRRSVORF6基因获得表达。以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔3次,获得抗PRRSV NJ-a株M蛋白的特异抗体。经Wes...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
姜有声 战文斌 程顺峰 王世表
为了更好地研究对虾白斑综合征病毒(WSSV)蛋白VP19在WSSV感染过程中的作用,利用VP19的单克隆抗体直接对VP19进行了定位。从患白斑综合征的中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃丝中提取WSSV,将提纯的WSSV经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,然后洗脱提纯其病毒蛋白VP19并免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合,用间接免疫荧光技术(IFAT)和Western-Blot技术筛选出1株阳性杂交瘤细胞,将检测出的阳性杂交瘤细胞经有限稀释法克隆,研制出抗VP19的单抗,再利用免疫胶体金技术对病毒蛋白VP19进行定位,结...
[期刊] 华北农学报
[作者]
卢晓艳 周永辉 李伟娟 张志远 刘肖萍 段二珍 夏平安 崔保安
扩增了自2006-2009年间从河南省不同地区分离的9株PRRSV株NSP2和GP5编码基因,并进行了序列测定和分析。结果显示,9株分离株NSP2全长2 850～2 937 bp,编码950～979个氨基酸,GP5基因全长603 bp,编码200个氨基酸,与CH-1a株比对,其中有7株分离株的NSP2基因均出现30个氨基酸的缺失。对9株分离株NSP2和GP5基因进行核苷酸序列分析并绘制进化树,结果表明,9株河南分离株都属于美洲型毒株,对9株PRRSV分离株NSP2和GP5基因同时进行序列分析,比较其变异结果是否一致,为进一步探寻PRRSV流行株遗传变异规律奠定了基础。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
梁望旺 杨克礼 伍锐 熊忠良 刘泽文 段正赢 徐涤平
为进一步了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在国内的分子遗传进化情况,对中国大陆1996~2008年间33株PRRSV分离毒株(29株来自GenBank)的GP5序列与国外部分代表毒株进行了分析比较。结果表明,所选PRRSV中国分离毒株中有32株属于北美洲型(NA),并大致可分为2个基因亚群,1株属于欧洲型(EU)。其中,自2006年在我国暴发的高致病性蓝耳病病毒(H-PRRSV)属于亚群1,且与YA株亲缘关系较近;亚群2毒株则与Ingelvac的弱毒疫苗株及其亲本株VR-2332具有较高的同源性。
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵娜 田宏 吴锦艳 满自萍 尚佑军 何生虎 刘湘涛
根据猪繁殖与呼吸综合症病毒已知序列(ch-1a,AY032626)设计包含完整ORF5序列的1对引物,采用RT-PCR方法扩增PRRSV甘肃LZH株的ORF5基因,将其克隆到杆状病毒载体pFastBacHTA上,经酶切鉴定、PCR鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBacHTA-ORF5,并对阳性质粒进行测序及序列分析;将pFastBacHTA-ORF5转化到DH10Bac感受态细胞中,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组转座子rBacmid-ORF5;并成功构建了PRRSV LZH株ORF5基因的杆状病毒载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王中明 李素平 夏平安 尹彦涛 李伟娟 邱璜 刘明莉 刘玉松 崔保安
根据GenBank中PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF3基因序列,利用Primer 5.0软件设计合成了1对特异性引物,经RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株扩增得到了大小为765 bp的片段,并将扩增的片段插入pTG19-T载体进行测序而获得含有ORF3的阳性克隆pTG19-T-GP3。将此基因亚克隆到原核表达载体pET-32a,经筛选获得了阳性重组质粒pET-GP3,进而在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为45 kDa的融合蛋白GP3-His,纯化后经Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。从而为进一步研究PRRSV次要结构蛋白GP3的免疫...
关键词：
PRRSV GP3蛋白 原核表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
车志芬 史西保 张改平 扣莉云 周景明 祁艳华 王爱萍
【目的】原核表达和纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的结构蛋白GP4,为深入了解其结构和功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增PRRSV BJ-4株ORF4基因片段,将其克隆到pMD19-T载体中并进行测序。从测序正确的重组质粒pMD19-T-ORF4中扩增缺失N端及C端疏水序列的基因片段tGP4(truncated GP4),再将其亚克隆到pET-32a载体并转化到大肠杆菌BL21,IPTG进行诱导表达。对表达的重组蛋白进行可溶性分析,使用尿素梯度法进行蛋白纯化,并通过ELISA法检测重组
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