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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
金光明 刘胜兵 杨倩 李玉磊
16头 5月龄长白×大约克夏二元杂交母猪 ,通过不同途径接种猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)弱毒疫苗 ,采用组织学方法研究其对母猪生殖道黏膜淋巴细胞分布的影响。结果表明 ,与对照组相比 ,鼻腔和肌注接种可使猪子宫角、子宫体和子宫颈黏膜上皮内淋巴细胞的数量极显著增加 (P
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
刘胜兵 杨倩 姜平
用猪繁殖与呼吸综合征 (PRRS) 弱毒苗分别通过生殖道黏膜免疫和肌肉注射免疫母猪 (各 4头 ), 另 4头经生殖道接种生理盐水作为对照, 运用免疫组化技术显示子宫局部IgA分泌细胞和IgG分泌细胞的分布。结果表明, 对照组子宫中IgA分泌细胞和IgG分泌细胞主要分布于黏膜固有层浅层, 子宫颈中的IgA分泌细胞数量多于子宫角, 而子宫角中IgG分泌细胞数量多于子宫颈。生殖道免疫后, 与对照组相比, 子宫角IgA分泌细胞数量极显著增多 (P
[期刊] 世界农业
[作者]
汤德元 汪忠荣 李诗举 李春燕
[期刊] 中国农业科学
[作者]
江云波 方六荣 肖少波 张辉 陈焕春
目的探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)自杀性DNA疫苗的免疫效果。方法将ORF5和ORF6基因分别插入可以同时表达两个外源基因的表达载体pSCA2的26S启动子下游,获得ORF5和ORF6双基因共表达自杀性DNA疫苗pSFV-56。结果Westernblot检测证实ORF5和ORF6基因获得正确表达,并且所表达的GP5和M蛋白可以形成异源二聚体。将pSFV-56免疫Balb/c小鼠,首免后4周可检测到特异性PRRSV中和抗体,首免后8周的中和抗体最高可达1﹕32,同时还可检测到较高的特异性细胞免疫应答。进一步将pSFV-56免疫断奶仔猪,二免后4周即可产生1:8～1:16的中和抗体,直到...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
魏春华 黄夏玲 杨圆 何乐 林志锋 徐叶 黄文琳 柳开隆 戴爱玲 杨小燕 刘建奎
[目的]利用DNA改组技术(DNA shuffling)对不同谱系的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因进行体外重组,构建具有良好交叉保护作用的DNA疫苗,为研制新型PRRSV疫苗提供参考。[方法]利用DNA改组技术对PRRSV谱系1、3、5.1、8.7毒株的ORF5基因进行体外突变重组,筛选去除信号肽的重组突变体。将重组突变体与真核表达载体pCAGGS-HA连接,构建重组表达质粒并进行酶切和测序鉴定,经脂质体转染MARC-145细胞,利用间接免疫荧光试验(IFA)和Western blotting试验检测目的蛋白的表达情况。将重组质粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46(ORF5基因重组的DNA疫苗)免疫小鼠,试验同时设pCAGGS-HA空载体组、PBS空白对照组、弱毒疫苗组(经典弱毒疫苗Ingelvac PRRS MLV,MLV组)和pCA-ORF5-MLV组(ORF5基因来自Ingelvac PRRS MLV),评估其免疫效果。[结果]筛选到2个去除信号肽的重组突变体(ΔORF5-8和ΔORF5-46)。成功构建重组表达质粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46,其可在MARC-145细胞中表达GP5蛋白。与pCAGGS-HA空载体组和PBS空白对照组相比,pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46组免疫小鼠血清白介素4(IL-4)和干扰素γ(INF-γ)含量均极显著提高(P<0.01),脾淋巴细胞增殖能力均极显著增强(P<0.01),均能产生针对GP5蛋白的抗体,血清中和试验表明,免疫组小鼠血清能对异源毒株产生交叉中和抗体(抗体平均滴度为10～16)。[结论]重组DNA疫苗pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46均能有效刺激并诱导机体产生细胞及体液免疫应答,具有良好的免疫原性。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
姜平 简中友 马志永 蔡家利 蔡宝祥
在对国内某地区７个患病猪群流行病学调查的基础上，用Ｍａｒｃ１４５细胞培养从４个猪群流产胎儿分离到３株导致细胞病变的病毒———Ｊ１、Ｊ２和Ｊ３株。它们对氯仿和热（５６℃，１ｈ）、甲醛、酸、碱均敏感。病毒粒子呈球状，直径３０～８０ｎｍ，负染后病毒粒子大小８０～１００ｎｍ，在Ｍａｒｃ１４５细胞质内增殖，５溴２′脱氧尿核苷（ＢＵＤＲ）对其无抑制作用。结合血清学试验，鉴定３个毒株均为猪繁殖和呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ），可能为美洲型ＰＲＲＳＶ。
关键词：
猪繁殖和呼吸综合征病毒 分离 鉴定
[期刊] 中国农业科学
[作者]
任慧英 郭鑫 杨汉春 王芳 赵东升 杜希珍
目的检测PRRSVGP5DNA重组质粒在猪体诱导的免疫反应以及细胞因子的佐剂效应。方法将表达PRRSVGP5的DNA重组质粒与表达3种细胞因子的重组质粒联合免疫SPF猪,经3次免疫后人工感染PRRSV,检测体液免疫、细胞免疫以及攻毒保护性反应。结果重组质粒pCI-GP5可诱导免疫猪产生中和抗体,效价达1:19.2,并可诱导机体产生较强的细胞免疫,攻毒后组织中PRRSV核酸的检出率下降39%,表明表达PRRSVGP5的DNA重组质粒pCI-GP5可诱导一定的免疫效力。pcDNA-IL-4与pCI-GP5共免可将中和抗体效价提高到1:35.5,且可增强细胞免疫反应,与对照组相比,病毒血症的出现频率...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
邱德新 陈焕春 吴斌 金梅林 申咏红 何信 龚文波
采用转瓶生产技术 ,在MARC 14 5细胞中增殖PRRSV克隆 2 0株 ,经过条件的优化选择 ,得到TCID50 ≥ 10 -7.55/mL的高滴度PRRSV溶液 ,为生产疫苗打下基础 ;所生产的PRRSV弱毒活疫苗对猪安全无致病性 ,能刺激猪产生特异性抗体应答 ,接种后第 14天可检测出特异性中和抗体。疫苗内的PRRSV滴度在冻干前后变化不大 ,冻干疫苗在 4～ 8℃保存有效期为 6个月 ,- 2 0℃保存有效期达 18个月 ,表明生产的PRRSV弱毒活疫苗对猪安全且能刺激猪产生体液免疫应答 ,可用于PRRS的预防接种。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王小敏 李燕华 蔺涛 刘闰夏 何孔旺 童光志 袁世山
旨为建立高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)野毒株持续性感染细胞模型。通过将HP-PRRSV野毒株JX143感染Marc-145细胞,感染的细胞经连续传代35代,建立了稳定的PRRSV持续感染的细胞模型,获得了JX143-Marc-145-P35细胞株。应用RT-PCR、免疫荧光、空斑形态分析等技术跟踪观察了JX143-Marc145细胞株连续传代过程中病毒在细胞内的存在和生物学特性的变化。为了进一步分析病毒持续性感染过程中基因的特征性变化,通过RT-PCR扩增出JX143-Marc145-P35的全基因,并进行测序和序列分析。结果表明,在细胞模型建立的过程中,细胞病变(Cyto...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
严亚贤 孙建和 王恒安 刘永德 华修国
对猪繁殖 呼吸综合征病毒 (PRRSV)上海分离株 (SH1)的理化特性和结构蛋白进行研究。结果表明 ,SH1分离株能致Marc 145细胞典型病变 ,TCID50 为 10 5 9mL-1,对氯仿和乙醚、酸 (pH5 5以下 )、碱 (pH8以上 )、热 (水浴 5 6℃ 10min以上、 37℃ 2 4h以上、 2 8℃ 48h以上 )均敏感。病毒负染可见以具囊膜的球形为主 ,囊膜上有纤突 ,大小为 60～85nm。超薄切片可见病毒存在于细胞浆中。SH1分离株的病毒培养液经差速离心和非线性蔗糖密度梯度纯化 ,SDS PAGE显示病毒结构蛋白的相对分子质量为 2 40 0 0 ,195 ...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
方剑玉 郑其升 郭小参 侯凤香 王琳 陶红梅 侯继波 陈溥言
采用RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)临床分离株的M基因(525 bp),通过设计4对引物,把M蛋白分成4段K1(78-112)、K2(98-131)、K3(118-153)、K4(139-174),分别扩增相应基因M1、K1、K2、K3和K4,连接pET-32a(+)表达载体,经鉴定后转化Escherichia coliBL21,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blot检测结果显示,分别在相对分子质量30.8×103和24.4×103位置出现目的条带,重组蛋白均可与阳性血清发生特异反应。将蛋白M1免疫BALB/c小鼠,于第三次免2周后从小鼠脾脏...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
刘惠莉 方莹
为探讨PRRSV非结构蛋白4(NSP4)功能,体外构建了pEGFP-N1-nsp4真核表达载体,转染Marc-145细胞,利用NSP4-GFP融合蛋白携带的绿色荧光标记,研究NSP4蛋白在Marc-145细胞中的定位,并根据蛋白疏水性设计构建含有nsp4基因N端不同长度的重组pEGFP-N1表达载体,转染细胞以进一步了解NSP4蛋白是否存在核定位信号序列及其在细胞中的分布。试验结果表明:融合蛋白主要位于细胞核,部分在胞浆内。PRRSV NSP4蛋白铰链区(hinge region,HR)145～168氨基酸是决定蛋白核内定位的功能区,该片段缺失影响NSP4蛋白进入细胞核。结论:体外转染细胞内表...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
周伦江 王隆柏 方勤美 吴学敏 车勇良 陈如敬 魏宏 庄向生
【目的】研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染MARC-145细胞生长相关蛋白表达量的变化,明确差异蛋白的功能信息,为深入研究PRRSV病毒复制和致病机理奠定基础。【方法】采用差异蛋白质组学和Western blotting技术,通过建立双向凝胶电泳,对高致病性PRRSV感染MARC-145细胞后表达量差异蛋白质进行了胶内酶解、质谱分析鉴定及数据库检索,明确差异蛋白质的相关信息。【结果】得到7个表达稳定、重复性好的蛋白点,其中有5个蛋白点找到匹配蛋白,分别为热休克蛋白70、硫氧还蛋白、S100钙结合蛋白A6、3-磷酸甘油脱氢酶和内参肌动蛋白,其余2个蛋白点为未知蛋白。在MARC-...
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨艳艳 乔松林 李睿 郭军庆 李青梅 滕蔓 王丽 赵东 李学伍 邓瑞广 张改平
为了得到一种能够高通量检测细胞培养物的方法,并将其用于筛选特异性强、敏感度高的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)单克隆抗体。用每孔能感染约100个细胞的病毒量接种单层覆盖96孔板的Marc-145细胞,12 h后用含3%H_2O_2的甲醇固定细胞,以制备免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)反应板。以100μL/孔的量将融合后继续培养10 d的杂交瘤细胞的培养上清加入至IPMA反应板,以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG-HRP作为二抗,以3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)作为显色底物,于倒置显微镜下进行观察。结果表明,共筛选出1D1、7G8等39份PRRSV单克隆抗体,这39份单抗能够使PRRSV中高致病毒株HN07-1和经典毒株BJ-4感染的Marc-145细胞被特异性染色,而对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒感染的Marc-145细胞无交叉染色。因此,构建的IPMA方法能够敏感、准确地捕捉到PRRSV单克隆抗体。
[期刊] 华北农学报
[作者]
马米玲 郝雪峰 关贵全 李有全 刘志杰 刘爱红 任巧云 牛庆丽 刘军龙 殷宏 罗建勋
用细胞传代的方法从湖南省宁乡县发病猪所采病料中分离到一株猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株。该毒株能在Marc-145细胞上增殖并产生特征性的细胞病变,RT-PCR检测可扩增出670bp的特异性的ORF5基因片段,经美洲型PRRSV荧光抗体染色呈阳性反应,电镜观察其超微结构显示,病毒粒子大小为50～60nm。命名该分离毒株为HN-HW株。
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