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[期刊] 世界农业
[作者]
汤德元 汪忠荣 李诗举 李春燕
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
魏春华 黄夏玲 杨圆 何乐 林志锋 徐叶 黄文琳 柳开隆 戴爱玲 杨小燕 刘建奎
[目的]利用DNA改组技术(DNA shuffling)对不同谱系的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因进行体外重组,构建具有良好交叉保护作用的DNA疫苗,为研制新型PRRSV疫苗提供参考。[方法]利用DNA改组技术对PRRSV谱系1、3、5.1、8.7毒株的ORF5基因进行体外突变重组,筛选去除信号肽的重组突变体。将重组突变体与真核表达载体pCAGGS-HA连接,构建重组表达质粒并进行酶切和测序鉴定,经脂质体转染MARC-145细胞,利用间接免疫荧光试验(IFA)和Western blotting试验检测目的蛋白的表达情况。将重组质粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46(ORF5基因重组的DNA疫苗)免疫小鼠,试验同时设pCAGGS-HA空载体组、PBS空白对照组、弱毒疫苗组(经典弱毒疫苗Ingelvac PRRS MLV,MLV组)和pCA-ORF5-MLV组(ORF5基因来自Ingelvac PRRS MLV),评估其免疫效果。[结果]筛选到2个去除信号肽的重组突变体(ΔORF5-8和ΔORF5-46)。成功构建重组表达质粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46,其可在MARC-145细胞中表达GP5蛋白。与pCAGGS-HA空载体组和PBS空白对照组相比,pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46组免疫小鼠血清白介素4(IL-4)和干扰素γ(INF-γ)含量均极显著提高(P<0.01),脾淋巴细胞增殖能力均极显著增强(P<0.01),均能产生针对GP5蛋白的抗体,血清中和试验表明,免疫组小鼠血清能对异源毒株产生交叉中和抗体(抗体平均滴度为10～16)。[结论]重组DNA疫苗pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46均能有效刺激并诱导机体产生细胞及体液免疫应答,具有良好的免疫原性。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
江云波 方六荣 肖少波 张辉 陈焕春
目的探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)自杀性DNA疫苗的免疫效果。方法将ORF5和ORF6基因分别插入可以同时表达两个外源基因的表达载体pSCA2的26S启动子下游,获得ORF5和ORF6双基因共表达自杀性DNA疫苗pSFV-56。结果Westernblot检测证实ORF5和ORF6基因获得正确表达,并且所表达的GP5和M蛋白可以形成异源二聚体。将pSFV-56免疫Balb/c小鼠,首免后4周可检测到特异性PRRSV中和抗体,首免后8周的中和抗体最高可达1﹕32,同时还可检测到较高的特异性细胞免疫应答。进一步将pSFV-56免疫断奶仔猪,二免后4周即可产生1:8～1:16的中和抗体,直到...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
任慧英 郭鑫 杨汉春 王芳 赵东升 杜希珍
目的检测PRRSVGP5DNA重组质粒在猪体诱导的免疫反应以及细胞因子的佐剂效应。方法将表达PRRSVGP5的DNA重组质粒与表达3种细胞因子的重组质粒联合免疫SPF猪,经3次免疫后人工感染PRRSV,检测体液免疫、细胞免疫以及攻毒保护性反应。结果重组质粒pCI-GP5可诱导免疫猪产生中和抗体,效价达1:19.2,并可诱导机体产生较强的细胞免疫,攻毒后组织中PRRSV核酸的检出率下降39%,表明表达PRRSVGP5的DNA重组质粒pCI-GP5可诱导一定的免疫效力。pcDNA-IL-4与pCI-GP5共免可将中和抗体效价提高到1:35.5,且可增强细胞免疫反应,与对照组相比,病毒血症的出现频率...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
邱德新 陈焕春 吴斌 金梅林 申咏红 何信 龚文波
采用转瓶生产技术 ,在MARC 14 5细胞中增殖PRRSV克隆 2 0株 ,经过条件的优化选择 ,得到TCID50 ≥ 10 -7.55/mL的高滴度PRRSV溶液 ,为生产疫苗打下基础 ;所生产的PRRSV弱毒活疫苗对猪安全无致病性 ,能刺激猪产生特异性抗体应答 ,接种后第 14天可检测出特异性中和抗体。疫苗内的PRRSV滴度在冻干前后变化不大 ,冻干疫苗在 4～ 8℃保存有效期为 6个月 ,- 2 0℃保存有效期达 18个月 ,表明生产的PRRSV弱毒活疫苗对猪安全且能刺激猪产生体液免疫应答 ,可用于PRRS的预防接种。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
姜平 简中友 马志永 蔡家利 蔡宝祥
在对国内某地区７个患病猪群流行病学调查的基础上，用Ｍａｒｃ１４５细胞培养从４个猪群流产胎儿分离到３株导致细胞病变的病毒———Ｊ１、Ｊ２和Ｊ３株。它们对氯仿和热（５６℃，１ｈ）、甲醛、酸、碱均敏感。病毒粒子呈球状，直径３０～８０ｎｍ，负染后病毒粒子大小８０～１００ｎｍ，在Ｍａｒｃ１４５细胞质内增殖，５溴２′脱氧尿核苷（ＢＵＤＲ）对其无抑制作用。结合血清学试验，鉴定３个毒株均为猪繁殖和呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ），可能为美洲型ＰＲＲＳＶ。
关键词：
猪繁殖和呼吸综合征病毒 分离 鉴定
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
严亚贤 孙建和 王恒安 刘永德 华修国
对猪繁殖 呼吸综合征病毒 (PRRSV)上海分离株 (SH1)的理化特性和结构蛋白进行研究。结果表明 ,SH1分离株能致Marc 145细胞典型病变 ,TCID50 为 10 5 9mL-1,对氯仿和乙醚、酸 (pH5 5以下 )、碱 (pH8以上 )、热 (水浴 5 6℃ 10min以上、 37℃ 2 4h以上、 2 8℃ 48h以上 )均敏感。病毒负染可见以具囊膜的球形为主 ,囊膜上有纤突 ,大小为 60～85nm。超薄切片可见病毒存在于细胞浆中。SH1分离株的病毒培养液经差速离心和非线性蔗糖密度梯度纯化 ,SDS PAGE显示病毒结构蛋白的相对分子质量为 2 40 0 0 ,195 ...
[期刊] 华北农学报
[作者]
韩一超 刘文俊 姚敬明 吴忻 王娟萍 武守艳 陈剑波 孟帆 郭慧慧 杨丽华 雷宇平 樊振华
采用RT-PCR方法,分段扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Shanxi-6株15个基因片段,并将这15个片段分别连接到pMD18-T载体上进行克隆测序、拼接后,得到PRRSV Shanxi-6株全基因组长15 320 bp(不包含PolyA尾),包含9个开放阅读框,5'UTR长189 bp,3'UTR长150 bp。基因组序列分析结果表明,Shanxi-6株与欧洲型代表毒株LV的核苷酸序列同源性为54.35%,与美洲型代表毒株VR-2332的核苷酸序列同源性为88.80%,与HPPRRSV毒株(JXA1、HUN4、HuN、HUB1)亲缘关系最近,核苷酸序列同源性高达97.44%~97...
关键词：
猪繁殖与呼吸综合征病毒 基因组 序列分析
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨艳艳 乔松林 李睿 郭军庆 李青梅 滕蔓 王丽 赵东 李学伍 邓瑞广 张改平
为了得到一种能够高通量检测细胞培养物的方法,并将其用于筛选特异性强、敏感度高的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)单克隆抗体。用每孔能感染约100个细胞的病毒量接种单层覆盖96孔板的Marc-145细胞,12 h后用含3%H_2O_2的甲醇固定细胞,以制备免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)反应板。以100μL/孔的量将融合后继续培养10 d的杂交瘤细胞的培养上清加入至IPMA反应板,以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG-HRP作为二抗,以3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)作为显色底物,于倒置显微镜下进行观察。结果表明,共筛选出1D1、7G8等39份PRRSV单克隆抗体,这39份单抗能够使PRRSV中高致病毒株HN07-1和经典毒株BJ-4感染的Marc-145细胞被特异性染色,而对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒感染的Marc-145细胞无交叉染色。因此,构建的IPMA方法能够敏感、准确地捕捉到PRRSV单克隆抗体。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵丽 刘永宏 焦海宏 张志峰 刘俊峰 陈兖州 温雅琴 刘博 李江涛 崔浩然 程波 张春光
【目的】确定新疆南疆猪养殖场是否存在PRRSV感染,以及感染的PRRSV毒株类型及基因特点,从而针对性的有效防制PRRS。【方法】设计7对引物,对疑似PRRS发病猪场组织样品进行RT-PCR、克隆、测序和序列分析。【结果】47例样品,35例PRRSV阳性,阳性率高达74.47%(35/47);35株均为美洲型毒株,其中有10株属于高致病性PRRSV,占总检测样品的21.28%(10/47),占阳性样品的28.57%(10/35);综合分析本研究采集样品猪养殖场不存在欧洲型毒株。【结论】新疆南疆存在美洲型PRRSV感染,且存在高致病性毒株。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
金光明 刘胜兵 杨倩 李玉磊
16头 5月龄长白×大约克夏二元杂交母猪 ,通过不同途径接种猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)弱毒疫苗 ,采用组织学方法研究其对母猪生殖道黏膜淋巴细胞分布的影响。结果表明 ,与对照组相比 ,鼻腔和肌注接种可使猪子宫角、子宫体和子宫颈黏膜上皮内淋巴细胞的数量极显著增加 (P
[期刊] 华北农学报
[作者]
马米玲 郝雪峰 关贵全 李有全 刘志杰 刘爱红 任巧云 牛庆丽 刘军龙 殷宏 罗建勋
用细胞传代的方法从湖南省宁乡县发病猪所采病料中分离到一株猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株。该毒株能在Marc-145细胞上增殖并产生特征性的细胞病变,RT-PCR检测可扩增出670bp的特异性的ORF5基因片段,经美洲型PRRSV荧光抗体染色呈阳性反应,电镜观察其超微结构显示,病毒粒子大小为50～60nm。命名该分离毒株为HN-HW株。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
周洪锐 汤起武 余兴龙 李润成 罗维 蒋大良 葛猛
采用小鼠体内试验和体外试验,利用Marc–145细胞体外培养系统,通过观察细胞病变来评价茶叶水提物对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)繁殖的抑制作用。改变加入茶叶水提取物的方式(茶叶水提物先与病毒感作后接种细胞、茶叶水提物与已感染病毒的细胞作用2种方式),初步探讨茶叶水提物对PRRSV的抑制与杀灭作用。体内试验是采用小鼠尾静脉注射的方法,将茶叶水提物注射到小鼠体内,测定小鼠血清对PRRSV的作用。结果表明,茶叶水提物对PRRSV具有杀灭与抑制作用,碧螺春茶(不发酵)、生普洱茶(不发酵)、铁观音茶(半发酵)、熟普洱茶(后发酵)的水提物对PRRSV的最小抑制质量浓度分别为31.3、31.3、31...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王旭荣 张彩勤 张春红 赵炳武 祝卫国 杨增岐 王建华 宋长绪
【目的】研究从江西、湖南发生持续高热的病猪体内分离的4株NSP2基因缺失的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Jiangxi-3、Jiangxi-4、Hunan-1、Hunan-2的致病力。【方法】通过Reed-Muench法,测定4株PRRSV(第3代)的TCID50,将毒株分别接种PRRSV和猪圆环病毒2型(PCV2)抗原与抗体均为阴性的健康猪,各设同居试验猪,通过检测体温、临床症状观察、RT-PCR、ELISA、病理切片等方法检测病毒的致病性。【结果】4株病毒的TCID50为10-3....
[期刊] 华北农学报
[作者]
王小敏 何孔旺 周忠涛 茅爱华 俞正玉 汪伟 倪艳秀 温立斌 张雪寒 郭容利 李彬 于洋
从江苏某猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场采集的血清样本中分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株,对该毒株的生物学特性进行了鉴定,并对其Nsp2和ORF5序列进行测定和序列比对分析。利用细胞传代的方法对PRRSV检测阳性,PPV和PRV检测阴性的猪血清进行病毒分离。通过RT-PCR、CPE和IFA对PRRSV分离毒株进行鉴定,并测定其TCID50。测序获得Nsp2和ORF5基因,并利用DNAStar软件进行序列同源性和进化分析。成功分离获得1株PRRSV毒株,该毒株能够在Marc-145细胞上增殖并产生细胞病变,免疫荧光检测可观察到特异性荧光,TCID50为105.5。Nsp2...
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