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[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
许静 代红梅 张霞 刘志朋 杨忠 李卫真 付仕颖 克比努尔·库尔班 霍金龙
【目的】Dickkopf样顶体蛋白1(DKKL1)是一种重要的顶体蛋白，为发掘其重要功能及潜在的临床价值，以版纳微型猪近交系(BMI)为对象，研究其睾丸组织中DKKL1的分子结构、转录调控特征和蛋白质功能。【方法】通过全转录组测序获得BMI DKKL1的表达量，使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得DKKL1编码区序列并分析其基因结构和蛋白质特征，使用UniProt数据库对DKKL1进行功能注释并分析DKKL1与微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)间的竞争性内源RNA(ceRNA)转录调控。【结果】获得的BMI DKKL1编码区全长为702 bp,位于基因第6号染色体上，有5个外显子和4个内含子；蛋白质功能分析表明，DKKL1包含233个氨基酸，具有疏水性，含磷酸化位点、信号肽和较多的无规则卷曲亚结构；系统进化和同源性分析表明，DKKL1氨基酸序列在哺乳动物间高度保守；蛋白互作分析显示，DKKL1与含螺旋结构域的蛋白155(CCDC155)、转录增强缔合域蛋白2(TEAD2)、RAS癌基因家族成员11B(RAB11B)等多种蛋白互作；基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析表明，这些蛋白富集在典型Wnt信号等通路上；GO功能注释表明，DKKL1在睾酮生物合成过程的负向调控、透明带穿透、顶体泡生成等方面具有重要功能；ceRNA转录调控网络分析表明，DKKL1被miR-15a和miR-15b靶向调控。【结论】本研究获得了BMI睾丸全转录数据，阐明了DKKL1的分子特征、蛋白质功能并构建了转录调控网络。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
代红梅 刘志朋 张霞 杨忠 曾日彬 王配 常勇诚 霍金龙
利用RT-PCR技术从版纳微型猪近交系睾丸组织中扩增出GSKIP全长编码序列并分析其分子特征，对GSKIP基因进行功能注释，分析其与非编码RNA(miRNA和lnRNA)间的调控关系，并构建ceRNA转录调控网络，进一步分析GSKIP蛋白的基本功能，构建多物种进化树和相互作用蛋白网络.通过RT-PCR获得了BMI GSKIP CDS区全长420 bp,该基因含4个外显子；基因功能分析表明，GSKIP主要参与Wnt信号通路；基因靶向作用分析表明，猪GSKIP受ssc-miR-181c、ssc-miR-181b、ssc-miR-181a、ssc-miR-335和miR-644-5p等5个miRNA的靶向调控；蛋白质结构分析表明，GSKIP包含1个DUF727结构域，α螺旋在二级结构中占比最高；多物种进化分析表明，BMI GSKIP氨基酸序列在哺乳动物中较为保守，与绵羊和牛的亲缘关系最为接近；蛋白互作网络分析表明，BMI GSKIP与10个蛋白存在相互作用.
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李贤 李齐发 赵兴波 徐洪涛 顾垚 朱翔 谢庄 刘红林
【目的】研究牦牛和犏牛Dmc1基因编码区序列、结构和睾丸组织mRNA表达水平,探讨Dmc1基因与犏牛雄性不育的关系,为揭示犏牛雄性不育的分子机理提供参考。【方法】通过PCR扩增和克隆测序获得牦牛和犏牛Dmc1基因部分cDNA序列,运用生物信息学方法分析牦牛和犏牛Dmc1基因编码区序列、蛋白结构和进化关系,利用实时荧光定量PCR技术检测牦牛和犏牛睾丸组织中Dmc1基因mRNA表达水平。【结果】牦牛和犏牛Dmc1基因编码区序列全长均为1023bp,编码340个氨基酸,与黄牛Dmc1基因的同源性为100%,与哺乳纲其它物种的同源性在90%以上。牦牛和犏牛Dmc1蛋白含有RecA蛋白家族典型的第二结构...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
房艳华 韦小敏 李肖 来航线 马小娟
【目的】对斜卧青霉转录调控因子Hac1进行染色质免疫共沉淀(CHIP)试验,为其调控机制及生物学功能研究奠定基础。【方法】以斜卧青霉为材料,DTT诱导转录调控因子Hac1表达,用交联Buffer处理菌丝,使Hac1与靶基因交联,超声破碎染色质后,进行解交联染色体检验,研究不同交联时间(5,10,20,30,40min)、不同菌丝用量(10mL CHIP缓冲液中分别添加0.25,0.50,1.00,1.50g菌丝)及不同超声功率(15,20,25,30 W)、超声时间(1,3,5s)、超声间隔时间(10,2
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
韩琪 胡波 李升云 董双林
[目的]本文旨在鉴定重要农业害虫斜纹夜蛾(Spodoptera litura)气味结合蛋白基因GOBP2的顺式作用元件,为揭示GOBP2的转录调控机制和开发基于嗅觉干扰的害虫防治技术奠定基础。[方法]利用5′RACE技术克隆GOBP2的5′UTR,确定转录起始位点;利用染色体步移技术(chromosome walking)克隆GOBP2的5′侧翼区,并利用在线网站预测转录因子结合位点;利用PCR克隆GOBP2的5′侧翼区逐步缺失片段,并构建到pGL3-Basic载体上;将各重组载体分别转染Sf9细胞,48 h后收获细胞并利用双荧光素酶报告系统检测转录活性。[结果]获得斜纹夜蛾GOBP2长23 bp的5′UTR,由此确定GOBP2的转录起始位点。通过染色体步移获得斜纹夜蛾GOBP2的5′端调控区2 025 bp的序列,发现启动子的典型TATA框;针对-1 000 bp序列的转录活性分析表明,最强转录活性区域位于-243～-207 bp,具有1个增强子;此外,在-971～-891 bp及-890～-811 bp各有1个增强子,在-244～-315 bp存在1个沉默子。[结论]获得斜纹夜蛾GOBP2的转录起始位点及顺式作用元件,为进一步研究GOBP2的转录调控机制奠定了基础。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
方所艳 朱琴 杨云会 关德军 张尚林 宋家瑶 张旭高 和四梅
【目的】探究灯盏花叶片数相关基因磷酸蛋白酶1（EbPP1）的功能，为揭示灯盏花叶片数目和开花时间分子机理奠定基础。【方法】从灯盏花叶片克隆EbPP1基因，将其构建至植物过表达载体RP101。用蘸花法侵染刚抽薹拟南芥植株进行异源表达，通过筛选获得若干株T_(1)、T_(2)、T_(3)代拟南芥阳性植株。最后统计T_(3)代阳性植株叶片数目和开花时间，通过实时荧光定量（RT-qPCR）检测EbPP1表达量，并测定拟南芥植株内源激素含量。【结果】成功克隆到全长EbPP1基因，并构建了该基因的重组过表达载体RP101-GFP-EbPP1。在拟南芥中实现了稳定的遗传转化，于T_(3)代中获得24株阳性EbPP1转基因植株，并对T_(3)代阳性植株进行实时荧光定量分析，RT-qPCR结果显示转基因拟南芥中EbPP1基因过量表达，其表达量从野生型的1.034增加至136.33；转基因拟南芥在表型上呈现出叶片数增多、开花时间延迟的特征；通过LC-MS定量测定植株内源激素含量显示，T_(3)代转基因拟南芥中吲哚-3-甲酸（ICA）和赤霉素24（GA24）等多种激素的含量明显高于野生型，其中生长素前体物质L-色氨酸（TRP）尤为显著，达到了野生型的3倍。【结论】本研究成功在拟南芥植株中异源表达EbPP1基因，与野生型相比，转基因拟南芥中叶片数增多，EbPP1基因表达量增高，内源激素含量升高。基于上述结果表明EbPP1可能通过调控植物激素水平，进而影响灯盏花叶片数目和开花时间。本研究为进一步解析灯盏花叶片数目发育相关机制和开花分子机理奠定基础，同时也为选育高品质灯盏花新品种提供一定的遗传基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
彭馥芝 冉茂良 翁波 李智 董莲花 陈斌
【目的】采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)对基因表达进行分析时,选择适当的内参基因是获得准确分析结果的关键。在猪睾丸分子生物学研究中,表达稳定的蛋白编码内参基因和micro RNA(miRNA)内参基因均有哪些目前尚不清楚。本研究旨在筛选出合适的内参基因,为准确定量不同时期猪睾丸组织中目的基因的表达提供可靠依据。【方法】选用8个不同发育时期(E 90、D 1、D 30、D 60、D 90、D 120、D 150、DM)的猪睾丸组织为材料,采用Trizol裂解法提取各样品的总RNA,利用Nan D
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
马小娟 韦小敏 来航线 房艳华 胡轶伦
【目的】以增强型绿色荧光蛋白为报告基因，构建斜卧青霉转录调控蛋白Ｈａｃ１激活形式基因（Ｈａｃ１ｉ）随机插入过表达菌株和非激活形式基因（Ｈａｃ１ｕ）原位插入过表达菌株，并初步观察Ｈａｃ１基因的２种不同编码蛋白在菌丝内部的运动情况，为进一步研究转录调控蛋白Ｈａｃ１的功能奠定基础。【方法】分别克隆ｐｔｒａ筛选标记、ｇｐｄａ启动子、Ｈａｃ１ｉ编码区、ｅｇＦｐ编码区及终止子，利用融合ｐｃｒ融合克隆片段，构建Ｈａｃ１ｉ随机插入表达盒；再分别克隆Ｈａｃ１上游臂及编码区、ｅｇＦｐ编码区及终止子、ｐｔｒａ筛选标记、Ｈａｃ１下游臂序列，融合克隆片段，构建Ｈａｃ１ｕ原位插入表达盒。将２种表达盒分别转化斜卧青霉原生质．．．
关键词：
斜卧青霉 荧光蛋白 转录调控蛋白Hac1
[期刊] 中国农业科学
[作者]
韩立强 王月影 王林枫 朱河水 钟凯 褚贝贝 杨国宇
【目的】固醇调节元件结合蛋白１（ＳＲＥＢＰ１）作为核转录因子，对于细胞脂肪合成酶基因的表达发挥着重要的调控作用。论文旨在奶牛乳腺上皮细胞中研究ＳＲＥＢＰ１对于ＳＣＤ１基因启动子的转录调控作用，为进一步明确ＳＲＥＢＰ１对于靶基因的转录调控机制提供理论基础。【方法】以荷斯坦奶牛乳腺组织的Ｃ ＤＮＡ为模板，采用分段克隆的方法获得ＳＲＥＢＰ１基因的编码序列，通过重组酶与ＰＣ ＤＮＡ３．１载体进行重组环化构建ＰＣ ＤＮＡ３．１－ＳＲＥＢＰ１表达载体，将构建的载体测序验证后提取质粒，转染奶牛乳腺上皮细胞。以ＥＩＦ３Ｋ基因为内参基因，采用荧光定量ＰＣＲ检测ＳＲＥＢＰ１基因ｍ ＲＮＡ的表达差异；采用免疫荧光的．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
石玉强 张涌 郑月茂 刘建忠 张志平
利用 PCR方法克隆了牛 β-乳球蛋白基因 5′调控成分 (1 4 4 9bp) ,其中包括 5′侧翼序列 (6 4 5 bp) ,第一外显子及第一内含子 (80 4 bp)。PCR产物回收纯化后 ,克隆在 p MD1 8- T Vector的 T位点。序列分析表明 ,该序列与牛 β-乳球蛋白 A型基因、牛 β-乳球蛋白 B型基因、山羊和绵羊 β-乳球蛋白基因的同源性分别为 98.5 5 % ,99.79% ,90 .70 %和 90 .0 9%。计算机分析表明 ,此调控成分含有诸多调节因子结合位点或反应元件 ,其中包括视黄酸反应元件 (RARE)、佛波酯反应元件 (TRE)、乳腺特异性因子 ...
关键词：
β-乳球蛋白基因 牛 PCR 序列分析
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
赵为民 曹静 邢菲 王丽 任守文 付言峰 李碧侠 方晓敏
为鉴定猪全基因组范围内蛋白编码基因3’UTR(3’–untranslated region)中反向重复PRE1(inverted repeated PRE1,IRPRE1)元件,对猪全基因组的22342个蛋白编码基因的3’UTR序列进行重复序列元件的生物信息学分析。结果表明:猪蛋白编码基因的3’UTR序列中短散在重复序列与简单重复序列在重复序列的类别中所占比例较高,分别为27.58%与31.08%;在SINE/t RNA的重复元件中,Pre0_SS和PRE1x元件所占的比例较高,分别为41.83%和37.51%;共有1 094个候选蛋白编码基因的3’UTR中含有IRPRE1元件;GO分析发现这些候选基因主要参与m RNA经由剪接体的剪接、细胞分裂、RNA通过酯交换反应发生的剪接、T细胞激活、RNA剪接、T细胞受体信号通路、对糖苷反应、甘油三酯稳态、外源性凋亡信号通路的正调节及胆固醇合成等生物过程;KEGG pathway分析发现这些候选基因参与了缬草碱、亮氨酸和异亮氨酸降解途径、TNF信号通路、T细胞受体信号通路、RIG–I样受体信号通路、吞噬体、剪接体、胆汁分泌、甲状腺激素合成和凋亡;对3个蛋白编码基因的3’UTR中的IRPRE1元件进行鉴定发现,其在多个组织中广泛表达。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李明桂 徐洪涛 李隐侠 于莎莉 赵兴波 潘增祥 朱翔 谢庄 李齐发
【目的】研究b-Boule基因5′调控序列的序列特征,以及牦牛、黄牛与犏牛睾丸组织b-Boule基因DMR甲基化状态的差异,为揭示b-Boule基因的表达调控和犏牛雄性不育的表观遗传机制提供依据。【方法】采用PCR扩增和克隆测序技术获得牦牛b-Boule基因5′调控序列,利用生物信息学方法分析b-Boule基因5′调控序列的序列特征,采用亚硫酸氢钠测序法检测牦牛、黄牛与犏牛睾丸组织中b-Boule基因DMR的甲基化状态。【结果】b-Boule基因5′调控序列长度为1 352 bp,核心启动子区含有SP1等甲基化敏感位点,5′端存在一个CpG岛。犏牛b-Boule基因DMR的甲基化水平(17.7...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
梁宏伟 李忠 罗相忠 邹桂伟
为研究黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)胰岛素样生长因子结合蛋白1基因(IGFBP1)的特征,阐明IGFBP1基因在不同性别黄颡鱼组织中的表达特征和IGFBP1蛋白在雌、雄黄颡鱼肌肉中的表达差异,克隆IGFBP1基因的c DNA全长,并进行实时荧光定量PCR检测和Western Blot分析。结果表明:黄颡鱼IGFBP1基因c DNA全长为1 259 bp,其开放阅读框长度为714 bp,编码237个氨基酸,3'端和5'端非翻译区分别为407 bp和138 bp;黄颡鱼IGFBP1基
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孙超 王力 齐仁立 姜东凤
【目的】克隆猪Musclin基因,分析和预测其编码蛋白的结构与功能。【方法】从猪肌肉组织中提取总RNA,RT-PCR扩增获得Musclin基因,对其进行克隆和测序,并根据生物信息学分析方法,利用Tmpred、SignalP3.0、TargetP 1.1等分析软件,对猪Musclin蛋白的跨膜结构、信号肽、细胞定位、结构特征等进行分析和预测。【结果】猪Musclin蛋白主要集中在分泌途径上,存在于细胞外,其核苷酸序列与家兔的具有较高的相似性,氨基酸序列32～45位和55～63位存在2个可能的强跨膜螺旋区,该蛋白的空间结构以α螺旋、β转角和无规则卷曲为主;其1～26位氨基酸序列是一段信号肽,在26...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王秋金 肖国强 滕爽爽
泥蚶(Tegillarca granosa)作为我国常见的滩涂养殖贝类，具有较高的经济价值。以弧菌为代表的条件致病菌一直以来是困扰双壳贝类健康养殖的一大难题。为了探讨泥蚶感染弧菌过程中,c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)介导的激活蛋白-1(activating protein-1,AP-1)先天免疫防御通路的作用及机制,本研究采用PCR技术克隆了泥蚶JNK基因(TgJNK)的c DNA序列,并对TgJNK和TgAP-1在弧菌感染下的表达和调控关系进行了分析。结果显示, TgJNK基因c DNA全长2696 bp,开放阅读框1332 bp,编码了443个氨基酸;蛋白多重比较和邻近系统发育树分析表明, TgJNK相对保守,存在一个STKc-JNK结构域,与长牡蛎(Crassostrea gigas)和紫贻贝(Mytilus edulis)的同源相似度较高。q RT-PCR和WB结果表明TgJNK在泥蚶的鳃中表达最高。哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）的浸泡感染可显著上调TgJNK的转录水平(P
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