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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
朱小甫 张志 李晓成 陈德坤 吴旭锦
为了优化猪瘟病毒的RT-nested PCR检测方法,对福建省猪瘟流行情况进行了调查。根据GenBank上发表的猪瘟病毒Shimen株基因序列设计并合成了2对引物,优化了猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的RT-nested PCR检测方法,并对所优化的RT-nested PCR特异性进行了检验。结果表明,该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为1×10-7ng/mL,只有CSFV扩增出了272 bp的目的条带,从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)阳...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王玉洁 刘金龙 彭树英 杨瑞锋 张涌
根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列,利用Primer5.0程序软件,设计并合成了M基因的2对引物,以mRNA为模板,通过RT-PCR,RT-nestedPCR方法,成功扩增出长度为1328bp和1037bp的TGEV目的片段,但未扩增出猪传染性腹泻病毒(PEDV)片段。在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了快速检测TGEV的诊断方法。结果表明,RT-nestedPCR方法可用于检测猪传染性胃肠炎病毒,而且此方法简单省时、灵敏性高,可以作为检测RNA病毒的一种分子生物学方法。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭抗抗 邓力 井勇 张彦明 王晶钰 宁蓬勃
【目的】建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法。【方法】根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。【结果】建立的RT-PCR检测方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187和492 bp的特异性片段,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。对10份疑似猪瘟临床样品进行检测...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘辉 熊金凤 邹浩勇 陈杨 杨维红 何启盖
根据猪瘟病毒(CSFV)的E2基因保守序列、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的ORF7基因及部分ORF6和3-UTR基因序列和猪乙型脑炎病毒(JEV)的E基因保守序列,设计了3对引物,扩增大小分别为288 bp4、30 bp和1 015 bp目的片段。以纯培养病毒抽提RNA,制备cDNA模板,利用3对引物,通过条件的优化,建立了同时检测这3种病毒的多重RT-PCR。CSFV、PRRSV和JEV的RNA最小检出量分别为0.270 ng、0.049 ng、0.067 ng,其它的RNA病毒如TGEV以及DNA病毒如PPV、PrV、PCV-2检测结果为阴性。以-βactin为对照,利用本方法...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
吴旭锦 朱小甫
【目的】建立一种基于E0基因高保守性的猪瘟病毒(CSFV)RT-nPCR检测方法,为临床诊断提供一种可靠方法,同时对获得的陕西猪瘟病毒E0基因进行序列分析,揭示猪瘟病毒基因的分子衍化特征,为防控猪瘟提供参考。【方法】根据GenBank中的猪瘟病毒参考序列,设计并合成了2对引物,建立猪瘟RT-nPCR检测方法,并对该方法的灵敏度和特异性进行检测。用该方法对采自陕西部分猪场的32份疑似猪瘟病料进行检测,并对获得的8株流行毒株E0基因进行测序及同源性分析。【结果】建立了猪瘟病毒RT-nPCR检测方法,该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为6.7×10-5 ng/L,从BVDV、PRRSV、PC...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
吴旭锦 朱小甫
【目的】建立一种基于E0基因高保守性的猪瘟病毒（CSFV）RT-nPCR检测方法，为临床诊断提供一种可靠方法，同时对获得的陕西猪瘟病毒E0基因进行序列分析，揭示猪瘟病毒基因的分子衍化特征，为防控猪瘟提供参考。【方法】根据GenBank中的猪瘟病毒参考序列，设计并合成了2对引物，建立猪瘟RT-nPCR检测方法，并对该方法的灵敏度和特异性进行检测。用该方法对采自陕西部分猪场的32份疑似猪瘟病料进行检测，并对获得的8株流行毒株E0基因进行测序及同源性分析。【结果】建立了猪瘟病毒RT-nPCR检测方法，该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为6.7×10-5 ng/L，从BVDV、PRRSV、PC...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张朝红 张彦明 张永国 郭抗抗 魏中锋 孙裴
应用病毒分离鉴定、荧光抗体法、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和夹心ELISA 4种方法,分别对23份猪瘟病料组织中的猪瘟病毒(CSFV)进行了检测,并比较4种检测方法的优缺点。结果显示,病毒分离鉴定法准确性较高,诊断比较容易,但存在试验步骤繁琐,所需时间长的缺点;荧光抗体检测法所需时间较短,但需要经验比较丰富人员来判定结果,且存在假阳性结果,特异性比较差;RT-PCR检测法具有快速、敏感等优点,特别是样品保存不理想时更有价值,利用套式PCR(nested-PCR)可以提高检测的特异性;夹心ELISA检测法具有快速、敏感等优点,但在样品保存不理想时会出现假阴性结果。
[期刊] 华北农学报
[作者]
路斌 王一成 吴润 袁秀芳 徐丽华 李军星 王朝文
通过对Genbank登录的CSFV、PRRSV和JEV的核苷酸序列进行比对分析,找出CSFV的E2基因,PRRSV的Nsp2基因和JEV的E基因为相对保守区域[1]。利用生物学软件在保守序列分别设计一对引物,通过对PCR反应条件的优化,确定了最佳引物浓度、最佳Mg2+浓度和最佳退火温度,建立了多重二温式PCR方法检测CSFV、PRRSV和JEV。其扩增的目的片断大小分别为CSFV(482 bp)、PRRSV(576 bp)和JEV(375 bp),将传统三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,从而大大节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对CSFV、PRRSV及JEV三种猪主要RNA病毒...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张帆帆 宋德平 周信荣 黄冬艳 李安琪 彭棋 陈燕君 吴琼 何后军 唐玉新
【目的】猪Ｄｅｌｔａ冠状病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｄｅｌｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，ＰＤｃｏｖ）是近年来新发现的可引起猪只，特别是新生仔猪腹泻的冠状病毒，其引发的腹泻具有较高的发病率和死亡率，是造成新生仔猪死亡的重要原因之一。试验拟建立新现ＰＤｃｏｖ ｒｔ－Ｐｃｒ检测方法，并调查当前江西腹泻猪群中ＰＤｃｏｖ的感染情况。【方法】通过对Ｇｅｎ Ｂａｎｋ数据库中ＰＤｃｏｖ全基因组序列的比对分析，找出保守序列，用Ｐｒｉｍｅｒ ３．０在线软件设计１对扩增ＰＤｃｏｖ核衣壳（ｎ）蛋白基因片段的特异性引物，基于该引物建立ＰＤｃｏｖ ｒｔ－Ｐｃｒ检测方法；用建立的方法检测腹泻猪粪便及肠道样品，挑选阳性扩增产物进行克．．．
[期刊] 中国水产科学
[作者]
罗卫 李惠芳 刘荭 陈焕春 范万红 刘宗晓 田飞焱 王侃 吕建强
根据GenBank中登录的鱼类神经坏死病毒CP基因序列,选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针,通过对实时荧光RT-PCR反应条件进行优化,建立了用于检测鱼类神经坏死病毒的实时荧光RT-PCR方法。利用该方法检测鱼类神经坏死病毒及其他多种常见的水生动物RNA病毒,结果只能检测到目的病毒,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,其最低检测限可达1.2pg/μL的总RNA。与RT-PCR的灵敏度对比试验表明,其敏感度比RT-PCR高100倍。对同一样品进行检测,在组内及组间的变异系数分别为0.9%以及1.5%,证实其重复性极好,并且从抽提核酸到得出结果仅需4h。对临床500份样品进行鱼类神...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张曼 韩飞
【目的】建立鉴别禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)和安卡拉病毒(FAV-4)的多重PCR检测方法。【方法】根据GenBank已登录的AIV的M基因、NDV的F基因和FAV-4的Hexon基因序列,设计合成了3对特异性引物。提取3种病毒DNA/RNA,通过优化多重PCR反应中的引物浓度和退火温度,建立快速鉴别3种病毒的多重PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检验。应用建立的多重PCR方法对67份临床病料进行检测,并将其结果与已建立的单重PCR检测结果进行比较。【结果】成功建立了能快速鉴
[期刊] 中国农业科学
[作者]
谢丽雪 郑姗 张立杰 张小艳 李韬
【目的】蓝莓休克病毒（ＢｌｕｅＢｅｒｒｙ ｓｈｏｃｋ ｖｉｒｕｓ，Ｂｌｓｈｖ）是蓝莓上主要病毒之一，侵染蓝莓后能够对其产量造成严重影响。研究旨在建立用于Ｂｌｓｈｖ快速检测的ｉｃ－ｒＴ－ｎｅｓＴｅｄ Ｐｃｒ技术，为该病毒的检测鉴定提供可靠的技术手段。【方法】根据ＧｅｎＢａｎｋ已报道的Ｂｌｓｈｖ基因序列，设计一对外侧引物（Ｂｌｓｈｖ－Ｆ／Ｂｌｓｈｖ－ｒ）和一对内侧引物（Ｂｌｓｈｖ－１／Ｂｌｓｈｖ－２），以感染Ｂｌｓｈｖ的蓝莓病叶为材料，利用免疫ｉｃ－ｒＴ－Ｐｃｒ（免疫捕获ｒＴ－Ｐｃｒ）和ｎｅｓＴｅｄ Ｐｃｒ（巢式Ｐｃｒ）建立Ｂｌｓｈｖ的ｉｃ－ｒＴ－ｎｅｓＴｅｄ Ｐｃｒ检测技术；分别以Ｂｌｓｈｖ、蓝．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘俊 王琴 范学政 徐璐 赵启祖 黄伟 汤波 沙莎 周远成 陈蕾 邹兴启
【目的】建立一种快速、敏感、特异地检测猪瘟病毒野毒的一步TaqMan-MGB荧光定量PCR方法,为临床鉴别猪瘟野毒和HCLV疫苗毒提供了准确可靠的工具。【方法】在猪瘟病毒基因组5′端非编码保守区设计一对猪瘟病毒通用引物和一条特异性MGB探针,通过优化,得到最佳反应体系和反应条件,进行特异性、灵敏度和临床样本符合检验。【结果】该方法在100～10-7范围内线性相关系数为0.998,检测极限达5.3×10-2pg病毒核酸;对24个质控样本检测结果显示,该方法能检测除猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)以外的猪瘟流野毒株,其它猪相关致病病原检测阴性;对122份疑似猪瘟样本检测的结果与本实验室建立的RT-nP...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
曹胜波 陈焕春 肖少波 何启盖 徐引弟 刘军发
根据国外已发表的猪环状病毒 2型 (PCV 2 )的全基因组序列 ,设计一对 2型特异性引物 ,对可疑病料进行PCR扩增。将扩增产物连接到pMD 18 T载体上并克隆到大肠杆菌DH5α中 ,经提取质粒进行PCR、酶切、测序鉴定 ,证明扩增出了PCV 2的目的片段。将测序结果与GenBank收录的PCV 2序列进行比较 ,发现同源性均在90 %以上。用该PCR方法在 43份可疑病料中检测到了 12份PCV 2阳性病料 ,表明该病在我国已有流行
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猪环状病毒2型 检测方法 聚合酶链反应
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