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[期刊] 中国农业科学
[作者]
朱元源 韩焘 邹兴启 范学政 徐璐 王琴 赵启祖
【目的】中国控制猪瘟主要采用疫苗免疫,现有的猪瘟兔化弱毒疫苗有较好的免疫保护效果,但是不能从血清学上区分疫苗免疫猪与自然感染猪,猪瘟标记疫苗的研制与配套检测技术的开发可有效解决这一问题。【方法】利用猪瘟病毒低温诱变弱毒T株感染性克隆,将其全长结构蛋白基因替换为猪瘟病毒石门毒株全长结构蛋白基因,得到猪瘟石门重组病毒的全长感染性克隆pSMT;随后在pSMT E1蛋白的C端插入Flag抗原基因作为鉴别标记,构建猪瘟石门重组标记病毒的感染性克隆pSMT-Flag。经电转染法拯救出两株重组病毒vSMT和vSMT-Flag,通过SK6细胞进行病毒传代以获得重组病毒。【结果】多组酶切鉴定表明两株重组质粒成功...
关键词：
猪瘟 重组病毒 Flag 标记疫苗
[期刊] 中国农业科学
[作者]
邹兴启 赵启祖 范运峰 朱元源 王琴 徐璐 范学政 宁宜宝
【目的】建立猪瘟病毒研究技术平台,为进一步研究猪瘟病毒C株在细胞中的增殖机制及猪瘟病毒标记疫苗奠定基础。【方法】本试验以猪瘟病毒C株为研究材料,经RT-PCR扩增获得涵盖全长的6个片段,用合适的酶切位点连接,成功构建了C株全长感染性克隆pAC-CS。体外转录得到RNA,然后将其分别转染BHK-21和SK6细胞。拯救的病毒通过上清传代(常规病毒传代)和带毒细胞传毒繁殖。【结果】通过RT-PCR、免疫过氧化酶单层细胞试验和兔体发热试验检测,表明病毒拯救成功。经比较以电转的方式转染SK6的效果较好。通过带毒细胞传代,至12代时病毒滴度稳定达104TCID50.mL-1,而上清传代至第3代时用免疫过氧...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
黄茜华 张楚瑜
根据已发表的猪瘟病毒序列，设计并合成了３对引物，利用ＲＴＰＣＲ技术，从猪瘟病毒石门株感染猪血中成功扩增了各ｃＤＮＡ片段，覆盖整个ＮＳ５Ａ基因，片段大小各为７７４，６８５，９１７ｂｐ。克隆后测序。序列比较结果显示，该基因在ＣＳＦＶ中较为保守。与同属的ＢＶＤＶ的序列同源性较低，且氨基酸的同源性低于核苷酸的同源性，推测它参与决定瘟病毒种的特异性。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
郭龙军 陆月华 黄立平 危艳武 刘长明
【目的】中国猪群中猪圆环病毒2型(PCV2)感染存在不同基因型毒株(PCV2a、PCV2b和PCV2d),有必要阐明不同基因型PCV2毒株的致病性差异。【方法】采用感染性克隆技术构建了不同基因型代表性毒株,对拯救的毒株进行体外生物学特性试验。【结果】构建了4个不同基因型的PCV2感染性分子克隆,经转化细胞后拯救4个克隆毒株,经核酸序列分析、病毒形态学观察、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)等证实属于不同基因型的PCV2毒株;拯救的毒株均通过细胞连续传10代,病毒增殖能力稳定,毒价均可达到105.0TCID50.mL-1;用具有中和病毒活性的单克隆抗体(1D2株)进行抗原捕获ELISA检测,...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孙永科 杨玉艾 王养会 李普华 张彦明
用已构建好的表达猪瘟病毒石门株E0基因的重组腺病毒pAd-E0、表达猪瘟病毒石门株E2基因的重组腺病毒pAd-E2以及联合表达猪瘟病毒石门株E0-E2基因的重组腺病毒pAd-E0-E2,肌肉和皮下接种免疫商品猪2次(间隔20 d),同时设非重组腺病毒PAD-CMV、常规猪瘟疫苗和空白对照组。二免21 d后进行CSFV石门株强毒超致死量(1 000倍TCID50)攻击,研究表达猪瘟保护性抗原基因重组腺病毒疫苗的免疫效果。结果表明,pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2免疫组猪的死亡率分别为50%,25%和25%,而常规猪瘟兔化弱毒疫苗免疫组的死亡率为40%,pAd-CMV免疫组和空白对照...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
鲁絮 张彦明 许信刚
采用PCR技术,扩增了猪瘟病毒石门株NS3基因的丝氨酸蛋白酶、NTPase、RNA解螺旋酶活性功能区长度为2 000 bp的片段,将其克隆到pET-32a中,构建了原核表达载体pET-NS3,并将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,同时对表达产物进行了SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,IPTG诱导表达得到的pET-NS3融合蛋白的相对分子质量约为97 ku,与预期结果一致,且该重组蛋白能被CSFV阳性血清所识别。
关键词：
猪瘟病毒 NS3基因 大肠杆菌
[期刊] 中国农业科学
[作者]
徐璐 范学政 王琴 蒋春燕 宁宜宝 王泰健
目的对猪瘟病毒石门株E2基因进行原核表达,以期获得可溶性表达产物,为检测猪瘟抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。方法用PCR技术扩增了重组S21质粒载体上的猪瘟病毒石门株E2基因的4个主要抗原结构域ABCD,A1A2,B和C。分别将4个片段克隆于pMAL-p2X载体中,经PCR、双酶切和测序鉴定,E2基因的4个主要抗原结构域片段的位置、大小和读码框均正确。将4个片段分别转化到表达菌TB1、BL21、BL21-CodonPlus(DE3)-RP和BL21(DE3)中,共得到16株重组表达菌,用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析。结果E2基因的4个主要抗原结构...
关键词：
猪瘟病毒 E2基因 抗原结构域原核表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
童超 陈宁 廖迅 袁雪梅 李肖梁 方维焕
【目的】目前使用的基因Ⅰ型猪瘟兔化弱毒C株疫苗是公认的安全、有效疫苗,但近年来基因Ⅱ群的猪瘟流行毒株比例增高,因此对猪瘟(CSF)的有效防控提出了更高要求。本研究旨在通过反向遗传学技术构建适应CSFV基因Ⅱ型的新型C株疫苗,为标记疫苗的开发奠定基础。【方法】在构建的C株感染性克隆基础上,拯救嵌合CSFV基因Ⅱ型HZ1-08毒株E2抗原区的重组C株病毒RecCHZE2,并分析其致病性和免疫原性。【结果】重组嵌合病毒RecCHZE2接种家兔后出现典型的定型热,兔脾脏肿大;重组嵌合病毒RecCHZE2接种猪只后没有发热和明显的白细胞减少,在接种后第12天检测到一过性的病毒血症;对接种猪血清检测结果表...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
魏中锋 张彦明 孙裴 张永国 洪海霞 倪斌 郭抗抗
根据已发表的猪瘟病毒基因组序列,设计合成了2对引物,以脾毒和细胞毒总RNA为模板,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、套式聚合酶链式反应(nPCR)及测序技术,对多次动物传代和致细胞病变的猪瘟病毒主要囊膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定,用DNAstar软件比较分析了E2基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性。结果发现,脾毒和标准石门株核苷酸序列的同源性为99.4%,氨基酸序列的同源性为99.0%;细胞毒与标准石门株核苷酸序列的同源性为98.3%,氨基酸序列的同源性为96.7%。由此说明,猪瘟病毒经猪体多次传代和组织培养致细胞病变后,均能保持遗传的稳定性。
[期刊] 华北农学报
[作者]
曹伟军 李平花 白兴文 卢曾军 孙普 刘在新
利用定点突变方法,构建含有预期突变的口蹄疫病毒O/HN/93株全长cDNA克隆,将全长cDNA的重组质粒线化后,与表达T7 RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,转染细胞盲传至第3代50 h后出现典型致细胞病变效应(CPE),第4代10 h出现典型的CPE。对收获的病毒分别用RT-PCR、分子标签测序、间接免疫荧光和电镜观察等进行鉴定,均证实成功拯救到了O/HN/93株FMDV。成功获得O/HN/93株的感染性分子克隆,为进一步研究抗原谱广、免疫原性好的候选疫苗株奠定了骨架基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
郭抗抗 雷安民 宁蓬勃 程敏 何雷 刘伟 谭学超 徐磊 曹伟伟 张彦明
【目的】构建转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的阳性细胞株,通过比较各细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果,筛选对猪瘟病毒增殖有明显抑制作用的细胞株,为抗猪瘟转基因猪的构建提供材料。【方法】研究设计了靶向猪Jiv基因的4个shRNA干扰片段,并构建插入干扰片段的慢病毒(P1、P2、P3、P4)。将慢病毒分别转染PK-15细胞,阳性细胞接种猪瘟病毒后72 h用实时荧光定量PCR检测猪瘟病毒RNA的量,以比较4种干扰细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果。将对猪瘟病毒增殖有较好干扰效果的P2慢病毒干扰载体转染猪胎儿成纤维细胞,获得稳定表达靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的猪胎儿成纤维细胞株,作为抗猪瘟病毒...
关键词：
猪瘟病毒 RNA干扰 慢病毒 转基因猪
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
马秋明 张建安 王强 朱小甫 王文江 何维明
根据GenBank公布的猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)Shimen株全基因序列,设计并合成2对引物,用RT-PCR方法对采自陕西省部分地区的30份CSF病料中,CSFV流行毒株的E2基因进行了扩增,并将其克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌DH5α。提取pMD-18T-E2重组质粒,进行BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定,并对阳性质粒进行测序,将测序结果与HCLV疫苗株和shimen株E2基因及E2蛋白进行序列分析。结果表明,从30份病料中共扩增到10株CSFV流行毒株的E2基因;扩增的10株陕西CSFV流行毒株E2基因同源性为92.3%~9...
关键词：
猪瘟 流行毒株 E2基因 序列分析
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘俊 王琴 范学政 徐璐 赵启祖 黄伟 汤波 沙莎 周远成 陈蕾 邹兴启
【目的】建立一种快速、敏感、特异地检测猪瘟病毒野毒的一步TaqMan-MGB荧光定量PCR方法,为临床鉴别猪瘟野毒和HCLV疫苗毒提供了准确可靠的工具。【方法】在猪瘟病毒基因组5′端非编码保守区设计一对猪瘟病毒通用引物和一条特异性MGB探针,通过优化,得到最佳反应体系和反应条件,进行特异性、灵敏度和临床样本符合检验。【结果】该方法在100～10-7范围内线性相关系数为0.998,检测极限达5.3×10-2pg病毒核酸;对24个质控样本检测结果显示,该方法能检测除猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)以外的猪瘟流野毒株,其它猪相关致病病原检测阴性;对122份疑似猪瘟样本检测的结果与本实验室建立的RT-nP...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘大飞 刘明 刘春国 杨涛 万春和 陈浩 齐金龙 杜金玲 李洪涛 孙恩成 刘大程
【目的】建立H1N1亚型猪流感病毒反向遗传学操作系统及拯救出能够在动物传代细胞中高水平复制的H1N1亚型猪流感疫苗株。【方法】利用反向遗传操作技术,对猪流感病毒广东分离株进行拯救。【结果】首次成功拯救出全部片段均来自于亲本株的猪流感病毒rH1N1,并且成功拯救出了具有高度细胞适应性毒株re-LM株,研究结果表明二者均具有良好的遗传稳定性。rH1N1经MDCK细胞连续传代培养后,血凝价最高仅为1:64;而re-LM的血凝价最高可以稳定在1:1024,表明该毒株具有细胞繁殖高产的特性。用该重组病毒制备油乳剂灭活苗免疫2月龄仔猪,首免2周即可检测出HI抗体,平均效价在1:32以上,三免后2周HI抗体...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭抗抗 邓力 井勇 张彦明 王晶钰 宁蓬勃
【目的】建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法。【方法】根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。【结果】建立的RT-PCR检测方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187和492 bp的特异性片段,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。对10份疑似猪瘟临床样品进行检测...
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